一種西羅莫司的高效液相色譜檢測方法與流程

本發(fā)明屬于藥物分析技術領域，具體涉及一種西羅莫司的高效液相色譜檢測方法。

背景技術：

西羅莫司(sirolimus)又稱雷帕霉素(rapamycin)，是一種親脂性含氮36元大環(huán)內酯類免疫抑制劑。1975年，加拿大Ayerst實驗室的Vezina等人從太平洋Easler島土壤樣品中分離的吸水鏈霉菌(Streptomyees hygroscopicus)發(fā)酵液中首次得到。1977年西羅莫司被發(fā)現(xiàn)具有免疫抑制作用，1989年開始把西羅莫司作為治療器官移植排斥反應的新藥進行使用。1999年10月惠氏制藥研制的西羅莫司口服溶液在美國首次上市，此后，1mg片劑也已在美上市。

國內西羅莫司產品主要有西羅莫司原料藥、西羅莫司膠囊及西羅莫司口服溶液。目前，西羅莫司原料藥及其制劑的有關物質與含量測定的現(xiàn)有檢測技術主要是國家食品藥品監(jiān)督管理局標準(企業(yè)注冊標準)，具體包括原料藥標準YBH09982005、YBH15302005、YBH02322008、YBH00972011和YBH01872012，膠囊標準YBH02472010，口服溶液標準YBH09992005、YBH14502005和YBH15312005。然而，各現(xiàn)有技術在重要參數質量控制上均存在顯著缺陷，例如：

(1)流動相系統(tǒng)上，多項現(xiàn)有技術使用了甲醇，而西羅莫司在甲醇中存在結構轉化現(xiàn)象，不適合作為溶解樣品的溶劑或作為流動相的一部分。凡采用甲醇作為流動相組成的色譜系統(tǒng)，其供試品溶液西羅莫司主峰均存在和其前洗脫的雜質峰分離較差的現(xiàn)象，該現(xiàn)象也從側面證實了以甲醇作為溶解樣品的溶劑及作為流動相的一部分在有關物質控制上的局限性；

(2)流動相組成均為有機溶劑-水混合物，流動相系統(tǒng)不調節(jié)pH，不利于開環(huán)降解產物如斷雷帕霉素等的控制，在此前提下采用等度洗脫方式，十分不利于弱極性強保留雜質的檢測；

(3)在有關物質雜質的控制上，有2項現(xiàn)有技術提到已知雜質去甲基西羅莫司，1項現(xiàn)有技術提到去甲基西羅莫司和開環(huán)降解轉化物，然而，其結論存在明顯的錯誤，這是因為：在西羅莫司的檢測過程中，所述開環(huán)降解轉化物已被證實為斷雷帕霉素與西羅莫司同系物及西羅莫司同分異構體的混合物，所述已知雜質去甲基西羅莫司已被證實為脯氨酰西羅莫司。

例如，中國專利申請CN105301159A披露了一種西羅莫司的高效液相色譜分析方法，其所采用的流動相為體積配比18：82～22：78的流動相A與流動相B的混合溶液，并且實施等度洗脫；其中，所述流動相A中的磷酸、庚烷磺酸鈉、水的質量配比為0.1:0.01:1，所述流動相B中甲醇與乙腈的體積配比為15：85；由此可見，該專利申請未能避免甲醇的使用，且沒有規(guī)避等度洗脫所帶來的技術問題。

綜上所述，現(xiàn)有技術在針對西羅莫司原料藥及其制劑的有效可控的質量控制方面存在諸多缺陷與不足。因此，亟需提供一種全新的西羅莫司的分析方法或檢測方法，在保證各相關雜質與有效成分高效分離的基礎上，使其具有良好的專屬性、重復性與準確度，從而更好地實現(xiàn)對西羅莫司的質量控制。

技術實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術中存在的缺陷與不足，發(fā)明人旨在提供一種既具有高的分離度，又具有良好的專屬性、重復性與準確度的分析方法或檢測方法，用于西羅莫司原料藥及其各種制劑的質量控制。

因此，本發(fā)明提供了一種西羅莫司的高效液相色譜檢測方法，包括以下步驟：

將西羅莫司溶解于無水乙腈，制得西羅莫司樣品溶液；取5～50μL進樣至HPLC系統(tǒng)，該進樣量與色譜柱載樣量或檢測器響應相適應；流速為1.0～2.5mL·min^-1，具體操作時，采用與所選擇的色譜柱尺寸相適應的流速；梯度洗脫，以277±2nm的檢測波長進行HPLC分析；

其中，采用C18反相色譜柱，流動相由乙腈和緩沖鹽溶液組成；所述緩沖鹽溶液的pH為2.0～7.5，且所述緩沖鹽溶液中鹽的濃度為5～100mmol/L；

其中，乙腈占流動相總體積的體積百分比濃度為50～100％。

優(yōu)選地，在上述西羅莫司的高效液相色譜檢測方法中，所述西羅莫司包括西羅莫司原料藥、西羅莫司片劑、西羅莫司膠囊或西羅莫司口服溶液。

優(yōu)選地，在上述西羅莫司的高效液相色譜檢測方法中，所述緩沖鹽溶液的pH為3.5～4.0。

優(yōu)選地，在上述西羅莫司的高效液相色譜檢測方法中，所述緩沖鹽溶液選自以下任一種體系：磷酸鹽緩沖體系、甲酸銨緩沖體系、乙酸銨緩沖體系、三氟乙酸緩沖體系。所述緩沖鹽溶液和質譜系統(tǒng)兼容，利于后續(xù)可實施的西羅莫司及其制劑中的雜質分析。

進一步優(yōu)選地，在上述西羅莫司的高效液相色譜檢測方法中，所述緩沖鹽溶液為甲酸銨緩沖體系。

優(yōu)選地，在上述西羅莫司的高效液相色譜檢測方法中，所述緩沖鹽溶液中鹽的濃度為20～50mmol/L。

進一步優(yōu)選地，在上述西羅莫司的高效液相色譜檢測方法中，所述流動相由緩沖鹽溶液、乙腈和改性劑組成。

更進一步優(yōu)選地，在上述西羅莫司的高效液相色譜檢測方法中，所述改性劑包括：甲基叔丁基醚和/或四氫呋喃。

更進一步優(yōu)選地，在上述西羅莫司的高效液相色譜檢測方法中，所述乙腈占流動相總體積的體積百分比濃度為50～99％，所述改性劑占流動相總體積的體積百分比濃度為1～5％。其中，所述改性劑的百分比濃度可根據西羅莫司的保留行為而做適當的調整。

綜上所述，本發(fā)明所提供的西羅莫司的高效液相色譜檢測方法，以無水乙腈為西羅莫司原料藥及其制劑的溶劑，并以乙腈和緩沖鹽溶液為流動相，可選地加入改性劑，意外地改善了脯氨酰西羅莫司、西羅莫司互變異構體A、去甲基西羅莫司及西羅莫司主峰之間的分離；其中，加入改性劑的主要目的和作用是調節(jié)西羅莫司及其雜質與固定相之間的相互作用力，最終目的是提高西羅莫司及其雜質之間的分離度，增加定量測定的準確度；從而避免了甲醇作為溶解樣品的溶劑或作為流動相的一部分時，在有關物質控制上的局限性。本發(fā)明涉及的西羅莫司原料藥及其制劑有關物質及含量測定的檢測方法操作簡便、專屬性好，樣品溶液穩(wěn)定性好，可有效分離西羅莫司、互變異構體A、同系物及其工藝副產物(如脯氨酰西羅莫司、去甲基西羅莫司)、開環(huán)降解產物(如斷雷帕霉素)等，檢出的雜質個數較多，各相關色譜峰(工藝副產物及開環(huán)降解產物等)之間分離良好，準確度高且重復性好，可有效克服現(xiàn)有技術中存在的缺陷，從而有效控制西羅莫司原料藥及其制劑的產品質量，亦可用于評估西羅莫司的生產工藝。

附圖說明

圖1～4依次為依據本發(fā)明實施例1所述的方法檢測企業(yè)A、企業(yè)B、企業(yè)C和企業(yè)D的西羅莫司原料藥所得到的典型液相色譜圖；

圖5為依據本發(fā)明實施例2所述的方法檢測企業(yè)B的西羅莫司膠囊所得到的典型液相色譜圖；

圖6為依據現(xiàn)有國家食品藥品監(jiān)督管理局標準在甲醇-乙腈-水流動相體系中檢測企業(yè)A的西羅莫司原料藥所得到的典型液相色譜圖；

圖7為依據現(xiàn)有技術在甲醇-水流動相體系中檢測企業(yè)A的西羅莫司原料藥所得到的典型液相色譜圖；

圖8為依據現(xiàn)有技術在乙腈-水流動相體系中檢測斷雷帕霉素所得到的典型液相色譜圖；

圖9為依據本發(fā)明實施例3所述的方法檢測企業(yè)A的西羅莫司原料藥所得到的典型液相色譜圖；

圖10為依據本發(fā)明實施例4所述的方法檢測企業(yè)A的西羅莫司膠囊所得到的典型液相色譜圖；

圖11為依據本發(fā)明實施例6所述的方法在磷酸鹽緩沖體系中檢測企業(yè)A的西羅莫司原料藥所得到的典型液相色譜圖；

圖12為依據本發(fā)明實施例6所述的方法在乙酸銨緩沖體系中檢測企業(yè)A的西羅莫司原料藥所得到的典型液相色譜圖；

圖13為依據本發(fā)明實施例6所述的方法在三氟乙酸緩沖體系中檢測企業(yè)A的西羅莫司原料藥所得到的典型液相色譜圖。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發(fā)明作進一步闡述，但本發(fā)明并不限于以下實施方式。

本發(fā)明提供了一種西羅莫司的高效液相色譜檢測方法，包括以下步驟：

將西羅莫司溶解于無水乙腈，制得西羅莫司樣品溶液；取5～50μL進樣至HPLC系統(tǒng)，流速為1.0～2.5mL·min^-1，梯度洗脫，以277±2nm的檢測波長進行HPLC分析；

其中，采用C18反相色譜柱，流動相由乙腈和緩沖鹽溶液組成；所述緩沖鹽溶液的pH為2.0～7.5，且所述緩沖鹽溶液中鹽的濃度為5～100mmol/L；

其中，乙腈占流動相總體積的體積百分比濃度為50～100％。

在一個優(yōu)選實施例中，所述西羅莫司包括西羅莫司原料藥、西羅莫司片劑、西羅莫司膠囊或西羅莫司口服溶液。

在一個優(yōu)選實施例中，所述緩沖鹽溶液的pH為3.5～4.0。

在一個優(yōu)選實施例中，所述緩沖鹽溶液選自以下任一種體系：磷酸鹽緩沖體系、甲酸銨緩沖體系、乙酸銨緩沖體系、三氟乙酸緩沖體系。

在一個進一步優(yōu)選的實施例中，所述緩沖鹽溶液為甲酸銨緩沖體系。

在一個優(yōu)選實施例中，所述緩沖鹽溶液中鹽的濃度為20～50mmol/L。

在一個進一步優(yōu)選的實施例中，所述流動相由緩沖鹽溶液、乙腈和改性劑組成。

在一個更進一步優(yōu)選的實施例中，所述改性劑包括：甲基叔丁基醚和/或四氫呋喃。

在一個更進一步優(yōu)選的實施例中，所述乙腈占流動相總體積的體積百分比濃度為50～99％，所述改性劑占流動相總體積的體積百分比濃度為1～5％。

以下實施例中采用的儀器為：Agilent 1200高效液相色譜儀，配備紫外檢測器、四元梯度泵、自動進樣器；電子天平(CP225D，德國Sartorius公司)。其中，高效液相色譜法所述使用的色譜柱為Kromasil C18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱；檢測波長為277nm；流速：1.5mL·min^-1，進樣體積：20μL。

實施例1

HPLC檢測

西羅莫司樣品溶液的制備：取西羅莫司原料藥，用無水乙腈溶解，配制成1mg/mL的溶液；取20μL西羅莫司樣品溶液，進樣，對西羅莫司原料藥中的主要成分、有關物質和雜質進行定性和定量分析；

其中，流動相A為20mM甲酸銨緩沖溶液(即甲酸銨緩沖體系，pH約為3.8)，流動相B為乙腈-甲基叔丁基醚(體積比99:1，下文中的百分比同樣表示體積百分比)，其中甲基叔丁基醚作為改性劑；線性梯度洗脫條件為：0～18min：43％A、57％B；18～25min：29％A、71％B；25～33min：100％B；33～43min：100％B(維持10分鐘)；43min后：43％A、57％B；

分別來自企業(yè)A、企業(yè)B、企業(yè)C和企業(yè)D的西羅莫司原料藥(不同來源的)的檢測結果見圖1～4。在圖1～4中，色譜峰1為西羅莫司，2為西羅莫司互變異構體C，其余色譜峰為主要雜質峰：3為脯氨酰西羅莫司，4為去甲基西羅莫司。

此實施例1的檢測結果表明，不同來源的西羅莫司原料藥之間的雜質譜存在較大差異；并且，西羅莫司主峰及其雜質峰得到了良好的分離。

對比例1

此外，發(fā)明人還依據現(xiàn)有國家食品藥品監(jiān)督管理局標準對企業(yè)A的西羅莫司原料藥進行了HPLC分析，其中采用甲醇-乙腈-水作為流動相，獲得了如圖6所示的液相色譜圖；如圖6所示，西羅莫司主峰1和其相鄰的主要工藝雜質——脯氨酰西羅莫司(雜質峰3)和去甲基西羅莫司(雜質峰4)不能得到有效分離。

進一步地，發(fā)明人按照實施例1中的步驟制備了源自企業(yè)A的西羅莫司原料藥的西羅莫司樣品溶液，并以相同的液相條件進行了HPLC分析，唯一的區(qū)別在于使用了甲醇作為流動相B，使用了水作為流動相A，該HPLC分析所獲得的液相色譜圖為圖7。如圖7所示，在采用甲醇-水作為流動相的條件下，西羅莫司主峰1前的多種雜質不能得到有效分離。

因此，發(fā)明人得出結論，無論是甲醇-乙腈-水流動相體系還是甲醇-水流動相體系，都會影響HPLC檢測中的分離效果，均難以準確反映西羅莫司的純度，進而難以獲得有效的質量控制。

通過比較實施例1與對比例1，可發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所建立的色譜分離系統(tǒng)，對西羅莫司和其工藝雜質及開環(huán)降解產物之間的分離良好，特別是脯氨酰西羅莫司與去甲基西羅莫司以及去甲基西羅莫司和西羅莫司之間的分離均較好，可以分別準確的控制主要工藝雜質的含量，同時有效反映西羅莫司的質量，從而可為企業(yè)生產工藝的監(jiān)控提供技術保障；與此同時，本發(fā)明所提供的西羅莫司的高效液相色譜檢測方法，通過對西羅莫司產品的質量控制，能夠有效區(qū)分不同的西羅莫司生產工藝的優(yōu)劣。由此可見，避免甲醇作為溶解樣品的溶劑或作為流動相的一部分，是本發(fā)明所述西羅莫司的高效液相色譜檢測方法取得優(yōu)異技術效果(主要是分離效果)的關鍵因素之一。

實施例2

HPLC檢測

西羅莫司樣品溶液的制備：取來自企業(yè)B的西羅莫司膠囊，用無水乙腈溶解，配制成0.5mg/mL的溶液；取20μL西羅莫司樣品溶液，進樣，對西羅莫司膠囊中的主要成分、有關物質和雜質進行定性和定量分析；

其中，流動相A為20mM甲酸銨緩沖溶液(即甲酸銨緩沖體系，pH約為3.8)，流動相B為乙腈-甲基叔丁基醚(體積比99:1，下文中的百分比同樣表示體積百分比)，其中甲基叔丁基醚作為改性劑；線性梯度洗脫條件為：0～18min：43％A、57％B；18～25min：29％A、71％B；25～33min：100％B；33～43min：100％B(維持10分鐘)；43min后：43％A、57％B；

檢測結果見圖5，其中：色譜峰1為西羅莫司，2為西羅莫司互變異構體C，其余色譜峰為主要雜質峰：其中4為去甲基西羅莫司，6為西羅莫司同系物，8為氧化物類似物，11為氧化聚合物類似物，12為西羅莫司互變異構體A(由西羅莫司和其互變異構體C相互轉化過程中產生，隨著樣品放置時間的增加含量增加；并且制劑過程也可產生)，13為斷雷帕霉素。

值得說明的是，斷雷帕霉素為西羅莫司的開環(huán)降解產物，通常在制劑過程或貯藏中產生，其作為制劑中表征降解產物的指針性雜質，是反映產品內在質量的主要考察指標之一。另外，所述斷雷帕霉素結構中含有羧基，因此，在乙腈-水流動相體系中斷雷帕霉素為解離狀態(tài)，HPLC檢測斷雷帕霉素時(液相條件和操作，與此實施例2中對西羅莫司膠囊檢測的液相條件和操作相同，唯一區(qū)別在于將西羅莫司膠囊替換為斷雷帕霉素標準品)，不被保留，且在死時間區(qū)域洗脫，如圖8所示。因此，在乙腈-水流動相體系中，對斷雷帕霉素的質量控制無法得以實現(xiàn)；對于膠囊等制劑來說，采用乙腈-水流動相體系的方法無法反映生產過程中的制劑工藝及貯藏過程對西羅莫司最終產品質量的影響。

由于本發(fā)明所建立的色譜分離系統(tǒng)的水相為一定pH值的緩沖溶液，這不僅有利于保障西羅莫司和其工藝雜質的分離，而且能夠增加主要開環(huán)降解產物——斷雷帕霉素的保留，同時確保降解產物和工藝雜質之間的分離維持良好，從而能夠有效反映并監(jiān)控制劑過程及貯藏過程中西羅莫司制劑的質量。

實施例3

HPLC檢測

西羅莫司樣品溶液的制備：取來自企業(yè)A的西羅莫司原料藥，用無水乙腈溶解，配制成1mg/mL的溶液；取20μL西羅莫司樣品溶液，進樣，對西羅莫司膠囊中的主要成分、有關物質和雜質進行定性和定量分析；

其中，流動相A為20mM甲酸銨緩沖溶液(即甲酸銨緩沖體系，pH約為3.8)，流動相B為乙腈-四氫呋喃(體積比97:3)，其中四氫呋喃作為改性劑；線性梯度洗脫條件為：0～20min：44％A、56％B；20～30min：57％A、43％B；30～40min：100％B；40～50min：100％B(維持10分鐘)；50min后：44％A、56％B；

檢測結果見圖9，其中：色譜峰1為西羅莫司，2為西羅莫司互變異構體C，其余色譜峰為主要雜質峰：其中3為脯氨酰西羅莫司，4為去甲基西羅莫司。

實施例4

HPLC檢測

西羅莫司樣品溶液的制備：取來自企業(yè)A的西羅莫司膠囊，用無水乙腈溶解，配制成0.5mg/mL的溶液；取20μL西羅莫司樣品溶液，進樣，對西羅莫司膠囊中的主要成分、有關物質和雜質進行定性和定量分析；

其中，流動相A為20mM甲酸銨緩沖溶液(pH約為3.8)，流動相B為乙腈-四氫呋喃(體積比97:3)，其中四氫呋喃作為改性劑；線性梯度洗脫條件為：0～20min：44％A、56％B；20～30min：57％A、43％B；30～40min：100％B；40～50min：100％B(維持10分鐘)；50min后：44％A、56％B；

檢測結果見圖10，其中：色譜峰1為西羅莫司，2為西羅莫司互變異構體C，其余色譜峰為主要雜質峰：其中4為去甲基西羅莫司，6為西羅莫司同系物，8為氧化物類似物，12為西羅莫司互變異構體A(由西羅莫司和其互變異構體C相互轉化過程中產生，隨著樣品放置時間的增加含量增加；并且制劑過程也可產生)，13為斷雷帕霉素。

實施例5

此外，發(fā)明人考察了改性劑對西羅莫司有關物質色譜峰分離效果的影響。

具體地，發(fā)明人按照實施例1中的檢測條件與操作步驟分別考察了不同體積百分比濃度的甲基叔丁基醚作為改性劑時，西羅莫司與其相關雜質之間的分離情況(參見下表1)；發(fā)明人按照實施例3中的檢測條件與操作步驟分別考察了不同體積百分比濃度的四氫呋喃作為改性劑時，西羅莫司與其相關雜質之間的分離情況(參見下表2)。

表1

表2

由于西羅莫司結構式中含有多個含氧極性基團，西羅莫司主要的生產工藝雜質為其結構類似物，簡單的常規(guī)流動相體系如甲醇體系、乙腈體系較難實現(xiàn)西羅莫司與其生產工藝雜質間的優(yōu)良分離。并且，西羅莫司在溶液中存在化學結構相互轉化的現(xiàn)象，這更增加了色譜分離的難度。

發(fā)明人在研究中意外地發(fā)現(xiàn)，將甲基叔丁基醚和四氫呋喃摻入流動相均可以調節(jié)西羅莫司及其相關雜質和流動相之間的相互作用力，進而改善結構相似的各種雜質之間以及各種雜質和西羅莫司主峰之間的分離。

如表1所示，隨著甲基叔丁基醚添加量的增加，脯氨酰西羅莫司和西羅莫司互變異構體A分離度顯著增加，西羅莫司互變異構體A和去甲基西羅莫司間分離度未見顯著增加；且隨著甲基叔丁基醚添加量的增加，西羅莫司和互變異構體間的分離難以通過乙腈比例的調節(jié)來改善，甲基叔丁基醚添加量過大時甚至導致了西羅莫司及其互變異構體之間的分離度更差；因此，表1中的數據說明甲基叔丁基醚和西羅莫司及其相關物質(各種雜質)之間的相互作用力均比較顯著，從而宜采用低的改性劑添加比例，即采用較少的甲基叔丁基醚添加量。

如表2所示，隨著四氫呋喃添加量的增加，脯氨酰西羅莫司和西羅莫司互變異構體A分離度顯著增加，西羅莫司互變異構體A和去甲基西羅莫司之間的分離度也呈現(xiàn)增加趨勢，并且可以通過調整流動相體系中乙腈的比例來調整西羅莫司的保留，且可以保證各相關檢測物之間良好的分離，例如，西羅莫司及其互變異構體之間的分離狀況良好；因此，表2中的數據說明四氫呋喃和西羅莫司及其相關物質(各種雜質)之間的相互作用力不同，因而，可通過乙腈比例的調節(jié)以調整西羅莫司的保留，并可通過適當提升四氫呋喃添加量來改善西羅莫司及其相關物質之間的分離，因此，四氫呋喃用作改性劑時的效果優(yōu)于甲基叔丁基醚；換言之，本發(fā)明所述的西羅莫司的高效液相色譜檢測方法更優(yōu)選四氫呋喃作為改性劑。

由此可知，發(fā)明人綜合考慮了脯氨酰西羅莫司、西羅莫司互變異構體A與去甲基西羅莫司三者之間的分離度，并在西羅莫司主峰的保留時間符合要求的前提下，本發(fā)明實施例1和2中以含改性劑甲基叔丁基醚為例進行闡述，所使用的甲基叔丁基醚的添加量約為1％；本發(fā)明實施例3和4中以含改性劑四氫呋喃為例進行闡述，所使用的四氫呋喃的添加量約為2％。

實施例6

此外，發(fā)明人考察了不同緩沖鹽溶液種類對西羅莫司有關物質色譜峰分離效果的影響。

具體地，發(fā)明人按照實施例1中的檢測條件與操作步驟分別考察了采用不同緩沖體系時(磷酸鹽緩沖體系、乙酸銨緩沖體系、三氟乙酸緩沖體系)，西羅莫司與其相關雜質之間的分離情況，即對西羅莫司有關物質色譜峰保留行為的影響。如圖11～13所示，其中，圖11顯示的來自企業(yè)A的西羅莫司原料藥的液相色譜圖對應磷酸鹽緩沖體系，圖12顯示的來自企業(yè)A的西羅莫司原料藥的液相色譜圖對應乙酸銨緩沖體系，圖13顯示的來自企業(yè)A的西羅莫司原料藥的液相色譜圖對應三氟乙酸緩沖體系；其中，西羅莫司主峰在各緩沖體系中均能夠與其相關雜質(主要為工藝雜質)之間分離良好。發(fā)明人通過分析認為，這一結果的主要原因為：西羅莫司及其工藝雜質均為近中性化合物，不含有可解離基團，因此對于不同的緩沖體系中未表現(xiàn)出明顯的分離差異。

對于西羅莫司的主要降解產物——斷雷帕霉素，由于其結構式中含有羧基，其保留行為易受流動相pH的影響。發(fā)明人在研究過程中發(fā)現(xiàn)，流動相pH值在3.5左右時，可實現(xiàn)斷雷帕霉素和工藝雜質(如脯氨酰西羅莫司、去甲基西羅莫司)之間的良好分離；考慮到各酸的pKa值及相應的緩沖范圍，并且為了通過可后續(xù)實施的質譜檢測等技術手段更好地實現(xiàn)對雜質譜的系統(tǒng)分析，更優(yōu)選權利要求1和2中所采用的甲酸銨緩沖體系，作為緩沖體系(緩沖鹽溶液)。

實施例7

另外，發(fā)明人考察了緩沖鹽溶液的不同濃度對西羅莫司有關物質色譜峰分離效果的影響。

具體地，發(fā)明人按照實施例1中的檢測條件與操作步驟分別考察了甲酸銨的濃度為5、10、20、25、50、100mmol/L的甲酸銨緩沖體系(甲酸銨溶液)，對西羅莫司與其相關雜質之間的分離情況的影響，即對西羅莫司有關物質色譜峰保留行為的影響。

檢測結果表明，隨著甲酸銨緩沖體系中甲酸銨濃度的增加，即隨著緩沖鹽溶液中鹽的濃度的增加，西羅莫司及其相關雜質之間的保留均減弱，但對各色譜峰之間的分離度未見顯著影響。發(fā)明人通過分析，認為其原因主要為：西羅莫司及其工藝雜質均為近中性化合物，不含有可解離基團，因此對于不同緩沖容量的甲酸銨緩沖溶液，僅表現(xiàn)為緩沖鹽離子強度差異所導致的色譜峰保留強弱略有不同，而并沒有對分離度產生顯著影響。綜合考慮緩沖體系的緩沖容量及各色譜峰的保留行為，優(yōu)選所述緩沖鹽溶液中鹽的濃度為20～50mmol/L。

以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發(fā)明的范圍內。