用高效液相色譜檢測(cè)泊沙康唑手性異構(gòu)體的方法與流程

本發(fā)明屬于藥物分析領(lǐng)域，具體涉及一種用高效液相色譜檢測(cè)泊沙康唑手性異構(gòu)體的方法。

背景技術(shù)：

泊沙康唑(posaconazole)是由美國(guó)schering-Plough公司研發(fā)公司研發(fā)的一種廣譜三唑類(lèi)抗真菌藥物。用于難治性疾病或其他藥物耐藥所引起的真菌感染。本品比對(duì)照藥物氟康唑和伊曲康唑，能更有效預(yù)防侵襲性曲霉菌感染并可降低侵襲性真菌感染相關(guān)的病死率。

泊沙康唑含有4個(gè)手性中心，除泊沙康唑外，還有15個(gè)手性異構(gòu)體。目前所用的藥物多為低于50個(gè)原子組成的有機(jī)小分子，很大一部分也具有手性，他們的藥理作用是通過(guò)與體內(nèi)大分子之間嚴(yán)格手性匹配與分子識(shí)別實(shí)現(xiàn)的。含手性因素的的化學(xué)藥物的異構(gòu)體在人體內(nèi)的藥理活性、代謝過(guò)程及毒性存在顯著的差異。藥物分子必須與受體(起反應(yīng)的物質(zhì))分子幾何結(jié)構(gòu)匹配，才能起到應(yīng)有的藥效，就如右手只能帶右手套一樣。因此，往往兩種異構(gòu)體中僅有一種是有效的，另一種無(wú)效甚至有害。例如，左西替利嗪是占抗過(guò)敏藥最大市場(chǎng)份額的西替利嗪的旋光體，比西替利嗪具有更高的藥效及更高的安全性；β-受體阻斷劑普萘洛爾的兩個(gè)對(duì)映異構(gòu)體的體外活性相差98倍；L―多巴是治療帕金森病的藥物，右旋體會(huì)聚積在體內(nèi)不會(huì)被體內(nèi)的酶代謝，從而可能對(duì)人體的健康造成危害；又如沙利度胺的兩個(gè)對(duì)映體中只有(R)―對(duì)映體具有緩解妊娠反應(yīng)作用而(S)―對(duì)映體是一種強(qiáng)力致畸劑，在妊娠第1～2個(gè)月內(nèi)服用會(huì)導(dǎo)致胎兒畸形。

根據(jù)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)對(duì)具有手性中心藥物的技術(shù)要求，需要對(duì)藥物的手性異構(gòu)體進(jìn)行控制。泊沙康唑有15個(gè)手性異構(gòu)體，但目前卻沒(méi)有與分離和控制泊沙康唑手性異構(gòu)體的文獻(xiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

泊沙康唑有15個(gè)手性異構(gòu)體，但在合成過(guò)程中可能生成的主要有9個(gè)，其結(jié)構(gòu)如下：

為保證臨床用藥的安全性，嚴(yán)格控制無(wú)效或具有副作用的手性異構(gòu)體的限度，同時(shí)彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)缺乏分離檢測(cè)泊沙康唑手性異構(gòu)體技術(shù)的不足，本發(fā)明的發(fā)明人開(kāi)發(fā)了一種用高效液相色譜法分離檢測(cè)泊沙康唑手性異構(gòu)體的方法，對(duì)泊沙康唑的手性異構(gòu)體進(jìn)行分析，從而保證藥物的安全性、質(zhì)量可控性。

在研究的過(guò)程中，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，因?yàn)椴瓷晨颠虻氖中援悩?gòu)體與泊沙康唑理化性質(zhì)類(lèi)似，盡管采用手性柱和常規(guī)的流動(dòng)相也很難將各成份在同一色譜條件下較好的實(shí)現(xiàn)基線分離。當(dāng)兩個(gè)雜質(zhì)峰完全重疊時(shí)，可以不影響總雜質(zhì)含量的檢測(cè)，但如果兩個(gè)雜質(zhì)部分交叉無(wú)法實(shí)現(xiàn)基線分離，則檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。

經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)和研究，本發(fā)明的發(fā)明人最終獲得一種用高效液相色譜檢測(cè)泊沙康唑手性異構(gòu)體的方法，能夠?qū)崿F(xiàn)泊沙康唑及其9個(gè)手性異構(gòu)體的有效分離，還能夠準(zhǔn)確測(cè)定泊沙康唑的含量及其手性異構(gòu)體的限度，專(zhuān)屬性強(qiáng)，靈敏度高；該操作方法簡(jiǎn)單，具有簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)點(diǎn)。所述方法包括如下步驟：

1)配置泊沙康唑手性異構(gòu)體混合對(duì)照品溶液和供試品溶液；

2)用高效液相色譜檢測(cè)供試品溶液和手性異構(gòu)體混合對(duì)照品溶液，色譜條件：使用以硅膠表面共價(jià)鍵合多糖衍生物為填料的色譜柱；采用雙流動(dòng)相，即流動(dòng)相A和流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫，所述流動(dòng)相A和B均為C2～C4鹵代烷烴和C1～C4醇類(lèi)的混合溶液，所述鹵代是指被至少一個(gè)選自氯、溴和碘的元素取代；

3)根據(jù)供試品溶液的色譜圖和手性異構(gòu)體混合對(duì)照品溶液的色譜圖，確定供試品溶液中手性異構(gòu)體的限度。

本發(fā)明的檢測(cè)方法采用雙流動(dòng)相，其中流動(dòng)相A和B均至少為二元流動(dòng)相，作為優(yōu)選，流動(dòng)相A為二元流動(dòng)相，流動(dòng)相B為三元流動(dòng)相。流動(dòng)相A和B均為C2～C4鹵代烷烴和C1～C4醇類(lèi)的混合溶液，所述烷烴包括支鏈和直鏈烷烴，可以是一種烷烴也可以是多種烷烴的混合，所述醇可以是一種醇也可以是多種醇的混合。本發(fā)明方法采用以硅膠表面共價(jià)鍵合多糖衍生物為填料的色譜柱，其分離效果符合分析檢測(cè)的要求，克服了現(xiàn)有技術(shù)無(wú)法在同一色譜條件下同時(shí)分離分析泊沙康唑的9個(gè)手性異構(gòu)體的難題。

作為優(yōu)選，本發(fā)明用于流動(dòng)相A和B的C2～C4鹵代烷烴選自于二氯甲烷、三氯甲烷中的一種或2種的混合，優(yōu)選為二氯甲烷。

作為優(yōu)選，本發(fā)明用于流動(dòng)相A和B的C1～C4醇類(lèi)選自于甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇中的一種或多種的組合。本發(fā)明所述的多種在無(wú)特殊說(shuō)明的情況下包括兩種或兩種以上，優(yōu)選為乙醇或乙醇和異丙醇的組合。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述流動(dòng)相A為二氯甲烷-異丙醇混合液，所述流動(dòng)相B為異丙醇-二氯甲烷-乙醇混合液。

作為優(yōu)選，所述流動(dòng)相A中二氯甲烷-異丙醇的體積比為(2-6)：(8-4)，所述流動(dòng)相B中異丙醇-二氯甲烷-乙醇的體積比為(5-7)：(4-0.5)：(1-2.5)。

作為優(yōu)選，所述流動(dòng)相A中二氯甲烷-異丙醇的體積比為(48～52)：(48～52)，作為更優(yōu)的選擇，流動(dòng)相A中二氯甲烷-異丙醇的體積比為1：1。

作為優(yōu)選，所述流動(dòng)相B為體積比為(55-65)：(40-25)：(5-10)的異丙醇-二氯甲烷-乙醇混合液，優(yōu)選所述流動(dòng)相B為體積比為6：3：1的異丙醇-二氯甲烷-乙醇混合液。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，步驟2)所述梯度洗脫的條件為：

0-8min，流動(dòng)相A相所占的體積比為：(12％～8％)→0％，流動(dòng)相B相所占的體積比為：(88％～92％)→100％；

8-50min，流動(dòng)相A相所占的體積比為：0％，流動(dòng)相B相所占的體積比為：100％；

50-55min，流動(dòng)相A相所占的體積比為：0％→100％，流動(dòng)相B相所占的體積比為：100％→0％；

55-80min，流動(dòng)相A相所占的體積比為：100％，流動(dòng)相B相所占的體積比為：0％。

作為優(yōu)選，高效色譜液相系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)的進(jìn)樣體積10～20μL，流動(dòng)相流速為0.9～1.1ml/min，色譜柱的柱溫為31～35℃，理論塔板數(shù)按泊沙康唑色譜峰計(jì)算不低于1000。

作為優(yōu)選，高效色譜液相系統(tǒng)的檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm。

作為優(yōu)選，上述步驟1)每1ml所述手性異構(gòu)體混合對(duì)照品溶液含2ug的單個(gè)異構(gòu)體，每1ml所述供試品溶液含2mg泊沙康唑樣品。

根據(jù)本發(fā)明提供的高效液相色譜條件，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇適宜的計(jì)算方法計(jì)算泊沙康唑含量和其手性異構(gòu)體的限度，所述計(jì)算方法包括但不限于內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法。

本發(fā)明的一些實(shí)施例采用雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法確定手性異構(gòu)體的限度，具體方法如下：

1)配制流動(dòng)相：分別配制流動(dòng)相A和流動(dòng)相B，以體積比1:1的二氯甲烷-異丙醇混合物為流動(dòng)相A，以體積比6:3:1異丙醇-二氯甲烷-乙醇混合物為流動(dòng)相B；

2)單個(gè)異構(gòu)體對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備：分別取前述泊沙康唑的9個(gè)手性異構(gòu)體，精密稱(chēng)定，加乙腈-異丙醇(75：:25)溶解，制成每1ml約含0.10mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

3)異構(gòu)體混合對(duì)照品溶液的制備：取用步驟2)單個(gè)異構(gòu)體對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.2ml，置10ml容量瓶中用異丙醇-二氯甲烷-乙醇(6:3:1)溶解，制成每1ml約含2ug的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

4)供試品溶液的制備：取泊沙康唑，精密稱(chēng)定，加異丙醇-二氯甲烷-乙醇(6:3:1)溶解，制成每1ml約含2mg的樣品溶液。

5)分別取步驟4)所述供試品溶液與步驟3)異構(gòu)體混合對(duì)照品溶液10μL注入分離檢測(cè)系統(tǒng)中，完成泊沙康唑異構(gòu)體的檢測(cè)。

其中所述高效液相色譜條件如下：

使用以硅膠表面共價(jià)鍵合多糖衍生物為填料的色譜柱；以流動(dòng)相A、B進(jìn)行梯度洗脫。用高效色譜液相系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)進(jìn)樣體積10μL；流速0.9～1.1ml/min；柱溫31～35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm。

所述梯度程序如下：

6)根據(jù)步驟5)檢測(cè)的色譜結(jié)果，采用外標(biāo)法的計(jì)算方法計(jì)算手性異構(gòu)體總雜質(zhì)含量。

試驗(yàn)結(jié)果證明本發(fā)明選用的色譜條件能較好地分離主成分及其異構(gòu)體，方法簡(jiǎn)便易行，能實(shí)現(xiàn)在同一色譜條件下檢測(cè)9個(gè)異構(gòu)體的總雜限度，更好地監(jiān)控泊沙康唑原料藥的質(zhì)量，同時(shí)也為制劑的質(zhì)量研究提供參考。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中分離度溶液的高效液相色譜圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中分離度溶液的高效液相色譜圖。

圖3為本發(fā)明比較例3中分離度溶液的高效液相色譜圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中分離度溶液的高效液相色譜圖。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例5中分離度溶液的高效液相色譜圖。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例5中樣品溶液的高效液相色譜圖。

具體實(shí)施方式

以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，所舉實(shí)施例是為了更好地對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行說(shuō)明，但并不是本發(fā)明的內(nèi)容僅限于所舉實(shí)施例。所以本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容對(duì)實(shí)施方案進(jìn)行非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

以下實(shí)施例檢測(cè)的泊沙康唑手性異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)為：

實(shí)施例1

儀器與色譜條件:

島津LC-10AD型高效液相色譜儀；色譜柱為IC色譜柱(250mm×4.6mm×5μm)；色譜柱柱溫33℃；以乙醇流動(dòng)相；用高效色譜液相系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)進(jìn)樣體積10μL；流速1.0ml/min；采用紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm。

實(shí)驗(yàn)步驟

單個(gè)異構(gòu)體對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備：分別取泊沙康唑的9個(gè)手性異構(gòu)體，精密稱(chēng)定，加乙腈-異丙醇(75：25)溶解，制成每1ml約含0.10mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

異構(gòu)體混合對(duì)照品溶液的制備：取用步驟1)單個(gè)異構(gòu)體對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.2ml，置10ml容量瓶中用乙醇溶解，制成每1ml約含2ug的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

供試品溶液的制備：取泊沙康唑，精密稱(chēng)定，加乙醇溶解，制成每1ml約含2mg的樣品溶液。

分離度溶液：取泊沙康唑，精密稱(chēng)定，加異構(gòu)體混合對(duì)照品溶液，制成每1ml約含2mg泊沙康唑的分離度溶液。

分別精密量取空白溶劑、供試品溶液、異構(gòu)體混合對(duì)照品溶液、分離度溶液各10μL，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。

試驗(yàn)結(jié)果表明，溶劑峰對(duì)泊沙康唑及其異構(gòu)體無(wú)干擾，分離度溶液異構(gòu)體的峰之間的不能全部基線分離。

實(shí)施例2

儀器與色譜條件:

島津LC-10AD型高效液相色譜儀；色譜柱為IC色譜柱(250mm×4.6mm×5μm)；色譜柱柱溫33℃；以二氯甲烷-異丙醇(1:4)為流動(dòng)相；用高效色譜液相系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)樣體積10μL；流速1.0ml/min；采用紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm。

其余操作步驟及條件均同實(shí)施例1。

試驗(yàn)結(jié)果表明，見(jiàn)圖2，溶劑峰對(duì)泊沙康唑及其異構(gòu)體無(wú)干擾，分離度溶液異構(gòu)體的峰之間的不能全部基線分離。

實(shí)施例3

儀器與色譜條件:

島津LC-10AD型高效液相色譜儀；色譜柱為IC色譜柱(250mm×4.6mm×5μm)；色譜柱柱溫33℃；以二氯甲烷-異丙醇(1:1)為流動(dòng)相A，以乙醇-異丙醇(1:3)為流動(dòng)相B；進(jìn)行梯度洗脫。用高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)樣體積10μL；流速1.0ml/min；采用紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm。

梯度洗脫程序如下：

其余操作步驟及條件均同實(shí)施例1。

試驗(yàn)結(jié)果表明，溶劑峰對(duì)泊沙康唑及其異構(gòu)體無(wú)干擾，分離度溶液異構(gòu)體的峰之間的不能全部基線分離，見(jiàn)圖3。

實(shí)施例4

儀器與色譜條件:

島津LC-10AD型高效液相色譜儀；色譜柱為IC色譜柱(250mm×4.6mm×5μm)；色譜柱柱溫35℃；；以二氯甲烷-異丙醇(48:52)為流動(dòng)相A,以異丙醇-二氯甲烷-乙醇(6:3:1)為流動(dòng)相B；進(jìn)行梯度洗脫。用高效色譜液相系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)進(jìn)樣體積10μL；流速1.0ml/min；采用紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm。

梯度洗脫程序如下：

實(shí)驗(yàn)步驟

單個(gè)異構(gòu)體對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備：分別取泊沙康唑的9個(gè)手性異構(gòu)體，精密稱(chēng)定，加乙腈-異丙醇(75：25)溶解，制成每1ml約含0.10mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

異構(gòu)體混合對(duì)照品溶液的制備：取用步驟1)單個(gè)異構(gòu)體對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.2ml，置10ml容量瓶中用異丙醇-二氯甲烷-乙醇(6:3:1)溶解，制成每1ml約含2ug的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

供試品溶液的制備：取泊沙康唑，精密稱(chēng)定，加異丙醇-二氯甲烷-乙醇(6:3:1)溶解，制成每1ml約含2mg的樣品溶液。

分離度溶液：取泊沙康唑，精密稱(chēng)定，加異構(gòu)體混合對(duì)照品溶液，制成每1ml約含2mg泊沙康唑的分離度溶液。

分別精密量取空白溶劑、供試品溶液、異構(gòu)體混合對(duì)照品溶液、分離度溶液各10μL，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖4。

試驗(yàn)結(jié)果表明，溶劑峰對(duì)泊沙康唑及其異構(gòu)體無(wú)干擾，樣品中未檢測(cè)出異構(gòu)體雜質(zhì)，分離度溶液各成分間的分離度均大于1.5。

實(shí)施例5

儀器與色譜條件:

島津LC-10AD型高效液相色譜儀；色譜柱為IC色譜柱(250mm×4.6mm×5μm)；色譜柱柱溫31℃；；以二氯甲烷-異丙醇(52:48)為流動(dòng)相A，以異丙醇-二氯甲烷-乙醇(6:3:1)為流動(dòng)相B；進(jìn)行梯度洗脫。用高效色譜液相系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)進(jìn)樣體積10μL；流速1.0ml/min；采用紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm。

梯度結(jié)構(gòu)如下：

其余操作步驟及條件均同實(shí)施例4。

試驗(yàn)結(jié)果表明，溶劑峰對(duì)泊沙康唑及其異構(gòu)體無(wú)干擾，分離度溶液各成分間的分離度均大于1.5，見(jiàn)圖5，樣品中未檢測(cè)出異構(gòu)體雜質(zhì)，如圖6,。

盡管已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明的實(shí)施方式，但是應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式做出各種改變、替換和變更。