可實現(xiàn)牛血清白蛋白鑒定及絕對定量的試劑盒及測定方法與流程

本發(fā)明涉及一種可實現(xiàn)牛血清白蛋白鑒定及絕對定量的檢測試劑盒及測定方法，屬于檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

牛血清白蛋白包含583個氨基酸殘基，分子量為66.430kDa，它在牛血液中約占50％，是血漿中主要載體，起維持滲透壓、pH緩沖、載體和營養(yǎng)作用，許多水溶性差的物質(zhì)可以通過與其結(jié)合而被運輸，如，膽紅素、長鏈脂肪酸、膽汁酸鹽、前列腺素、類固醇激素、金屬離子及藥物等。在牛乳總蛋白中約占1％-2％，在牛乳成分分析檢測領(lǐng)域中起重要作用。

目前，國內(nèi)外檢測牛血清白蛋白的主要方法有ELISA法、凱氏定氮法、雙縮尿法、Folin-酚試劑法、紫外吸收法、考馬斯亮藍法、熒光光度法、共振光散射法、電化學(xué)法和毛細管電泳法。其中ELISA試劑盒具有檢測特異性高的優(yōu)點，但由于采用分光光度法測定，有易污染、背景值高的缺點，常使檢測靈敏度降低。凱氏定氮法、雙縮尿法、Folin-酚試劑法和考馬斯亮藍法均是采用分光光度法測定，與紫外吸收法、熒光光度法、共振光散射法、電化學(xué)法相同，均具有檢測專屬性、靈敏度和準(zhǔn)確度低的缺點。檢索發(fā)現(xiàn)，申請?zhí)枮?01010134403.7的專利申請公開了一種檢測牛乳中牛血清白蛋白含量的方法，采用的高壓毛細管電泳法雖有較高準(zhǔn)確度，但常易受到分子量大小接近的蛋白干擾，使檢測特異性、靈敏度降低，并且檢測時間較長，不適合痕/微量牛血清白蛋白的檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

技術(shù)問題：本發(fā)明的目的是提供一種牛血清白蛋白檢測試劑盒，給出一種采用本試劑盒可以克服現(xiàn)有技術(shù)缺點的牛血清白蛋白的鑒定和含量測定的方法。該試劑盒給出了檢測牛血清白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和對含血清白蛋白樣品進行酶解反應(yīng)的反應(yīng)試劑。可將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和/或酶解反應(yīng)產(chǎn)物(或含內(nèi)標(biāo)物質(zhì))注入(超)高效液相色譜-質(zhì)譜儀中進行牛血清白蛋白含量測定。本發(fā)明提供了一種專屬性強、精密度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、操作簡便，可用于樣品中牛血清白蛋白含量測定的一種檢測試劑盒及檢測方法。

技術(shù)方案：

一種可實現(xiàn)牛血清白蛋白鑒定及絕對定量的試劑盒，其特征在于：包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包括特征肽段及其內(nèi)標(biāo)肽段，肽段序列為：

該試劑盒還包括反應(yīng)試劑：

反應(yīng)試劑，由以下成分組成：

所述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特征肽段單獨使用或者與另一特征肽段配成兩種混合特征肽段使用。

所述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的內(nèi)標(biāo)肽段單獨使用或者與另一內(nèi)標(biāo)肽段配成混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)使用，或與其他特征肽段配成混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)使用。

所述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特征肽段與其內(nèi)標(biāo)肽段配成的混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，單獨使用或與另外一種混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)同時使用。

內(nèi)標(biāo)肽段與其他內(nèi)標(biāo)肽段混合使用。

1)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

①用以實現(xiàn)本發(fā)明試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是標(biāo)準(zhǔn)特征肽段，是單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，或配成雙混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使用其中的一種或多種；

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)I

特征肽段1 DAFLGSFLYEYSR

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)II

特征肽段2 AEFVEVTK

雙混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

特征肽段1 DAFLGSFLYEYSR

特征肽段2 AEFVEVTK

②用以實現(xiàn)本發(fā)明試劑盒的內(nèi)標(biāo)肽段，是單一內(nèi)標(biāo)肽段，或配成雙混合內(nèi)標(biāo)肽段，可使用其中的一種或多種；

單一內(nèi)標(biāo)肽段I

內(nèi)標(biāo)肽段1 DAFLGSFLYEYSR

單一內(nèi)標(biāo)肽段II

內(nèi)標(biāo)肽段2 AEFVEVTK

雙混合內(nèi)標(biāo)肽段

內(nèi)標(biāo)肽段1 DAFLGSFLYEYSR

內(nèi)標(biāo)肽段2 AEFVEVTK

③將上述特征肽段與其內(nèi)標(biāo)肽段聯(lián)合使用，是單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，或配成混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，使用其中的一種或多種；

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I

特征肽段1 DAFLGSFLYEYSR

內(nèi)標(biāo)肽段1 DAFLGSFLYEYSR

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)II

特征肽段2 AEFVEVTK

內(nèi)標(biāo)肽段2 AEFVEVTK

混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I

特征肽段1 DAFLGSFLYEYSR

特征肽段2 AEFVEVTK

內(nèi)標(biāo)肽段1 DAFLGSFLYEYSR

混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)II

特征肽段1 DAFLGSFLYEYSR

特征肽段2 AEFVEVTK

內(nèi)標(biāo)肽段2 AEFVEVTK

混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)III

④用以實現(xiàn)本發(fā)明方法的牛血清白蛋白檢測試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是單劑、或是雙劑或多劑，根據(jù)上述方法自由組合或選擇其中的一種或多種。

所述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配成單劑、雙劑或多劑。

所述胰蛋白酶為序列級胰蛋白酶、胰蛋白酶中的至少一種。

所述反應(yīng)試劑配成單劑。

利用上述的可實現(xiàn)牛血清白蛋白鑒定及絕對定量的試劑盒所實施的牛血清白蛋白含量測定方法，其特征在于：該方法步驟如下：

(1)將待測樣品加入碳酸氫銨，渦旋，加入二硫蘇糖醇，溫育振蕩，再加入碘乙酰胺，溫育振蕩，放置至室溫后，再加入胰蛋白酶，溫育振蕩，最后加入甲酸終止反應(yīng)。

(2)將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和(1)步驟中最終產(chǎn)物分別注入高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀中檢測，或?qū)⒒旌蟽?nèi)標(biāo)物質(zhì)和(1)步驟中最終產(chǎn)物(含內(nèi)標(biāo)肽段)分別注入高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀中檢測，通過m/z及t_R進行定性，色譜峰峰面積變化測算出牛血清白蛋白的絕對含量；

溫育溫度控制在25～60℃范圍，溫育時間控制在0.5～12h，振蕩頻率控制在800～2500rmp，渦旋時間控制在2～10min，室溫控制在18-22℃范圍。

胰蛋白酶與被測樣品總蛋白量比例控制在1/1到1/100。

所述步驟(2)為：將特征肽段(一種或兩種)和(1)步驟中最終產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀中檢測，或?qū)⒒旌蟽?nèi)標(biāo)物質(zhì)和(1)步驟中最終產(chǎn)物(含一種或兩種內(nèi)標(biāo)肽段)分別注入(超)高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀中檢測，通過m/z及t_R進行定性鑒別，色譜峰峰面積變化測算出牛血清白蛋白的含量。

有益效果：本發(fā)明提供的檢測試劑盒及檢測方法能對樣品中牛血清白蛋白進行準(zhǔn)確靈敏的定性和絕對定量，具有特異性強、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡便等優(yōu)點。

本發(fā)明包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(由特征肽段及其內(nèi)標(biāo)肽段組成)和酶解反應(yīng)試劑；采用(超)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進行檢測，這是一類采用高效液相色譜分離，串聯(lián)質(zhì)譜檢測碎片離子的設(shè)備，能快速、精確、靈敏的對微/痕量的牛血清白蛋白進行絕對定量。該方法具有操作簡便、特異性強、靈敏度和準(zhǔn)確度高的特點，檢測時間在7min之內(nèi)完成。

目前，尚未開發(fā)出測定牛血清白蛋白含量的特征肽段及其內(nèi)標(biāo)肽段和酶解反應(yīng)試劑的試劑盒。本發(fā)明成功的彌補了生物/化學(xué)檢測領(lǐng)域的不足，能準(zhǔn)確地對含微/痕量牛血清白蛋白的樣品進行定性鑒別和絕對定量，具有特異性強、操作簡便、靈敏度和準(zhǔn)確度高的優(yōu)點。

附圖說明：

圖1為特征肽段1的二級質(zhì)譜圖(m/z＝784.3)；

圖2為特征肽段4的二級質(zhì)譜圖(m/z＝461.6)；

具體實施方式

通過以下實施例進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明的權(quán)利要求不僅限于實施例。

本發(fā)明包括牛血清白蛋白檢測試劑盒和含量測定方法兩部分。

牛血清白蛋白檢測試劑盒由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和反應(yīng)試劑兩部分組成：

1)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

①用以實現(xiàn)本發(fā)明試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是標(biāo)準(zhǔn)特征肽段，可以是單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，或配成雙混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可使用其中的一種或多種。

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)I

特征肽段1 DAFLGSFLYEYSR

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)II

特征肽段2 AEFVEVTK

雙混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

特征肽段1 DAFLGSFLYEYSR

特征肽段2 AEFVEVTK

②用以實現(xiàn)本發(fā)明試劑盒的內(nèi)標(biāo)肽段，可以是單一內(nèi)標(biāo)肽段，或配成雙混合內(nèi)標(biāo)肽段，可使用其中的一種或多種。

單一內(nèi)標(biāo)肽段I

內(nèi)標(biāo)肽段1 DAFLGSFLYEYSR

單一內(nèi)標(biāo)肽段II

內(nèi)標(biāo)肽段2 AEFVEVTK

雙混合內(nèi)標(biāo)肽段

內(nèi)標(biāo)肽段1 DAFLGSFLYEYSR

內(nèi)標(biāo)肽段2 AEFVEVTK

③將上述特征肽段與其內(nèi)標(biāo)肽段聯(lián)合使用，以下簡稱“內(nèi)標(biāo)物質(zhì)”，更有利于谷氨酸轉(zhuǎn)運體-1蛋白的定性和定量檢測?？梢允菃我粌?nèi)標(biāo)物質(zhì)，或配成混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，可使用其中的一種或多種。

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I

特征肽段1 DAFLGSFLYEYSR

內(nèi)標(biāo)肽段1 DAFLGSFLYEYSR

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)II

特征肽段2 AEFVEVTK

內(nèi)標(biāo)肽段2 AEFVEVTK

混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I

特征肽段1 DAFLGSFLYEYSR

特征肽段2 AEFVEVTK

內(nèi)標(biāo)肽段1 DAFLGSFLYEYSR

混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)II

特征肽段1 DAFLGSFLYEYSR

特征肽段2 AEFVEVTK

內(nèi)標(biāo)肽段2 AEFVEVTK

混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)III

④用以實現(xiàn)本發(fā)明方法的牛血清白蛋白檢測試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以是單劑、也可以是雙劑或多劑，可根據(jù)上述方法自由組合或選擇其中的一種或多種。

2)反應(yīng)試劑，用以實現(xiàn)本發(fā)明方法的反應(yīng)試劑是單劑，包括：

本發(fā)明測定牛血清白蛋白含量的步驟如下：

(1)將樣品加入碳酸氫銨，振蕩混勻，加入二硫蘇糖醇，溫育振蕩，再加入碘乙酰胺，溫育振蕩，放置至室溫后，再加入胰蛋白酶，溫育振蕩，最后加入甲酸終止反應(yīng)。

(2)將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和最終產(chǎn)物(或含內(nèi)標(biāo)肽段)分別注入(超)高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀中檢測，通過m/z及t_R進行定性鑒別，色譜峰峰面積變化測算出樣品中牛血清白蛋白的含量。

通常步驟(1)溫育溫度控制在25～60℃范圍，溫育時間控制在0.5～12h，振蕩頻率控制在800～2500rmp，胰蛋白酶與被測樣品總蛋白量比例控制在1/1到1/100，渦旋時間控制在2～10min。

所述步驟(2)將特征肽段(一種或兩種)和最終產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀中檢測，或?qū)⒒旌蟽?nèi)標(biāo)物質(zhì)(一種或兩種)和最終產(chǎn)物(含內(nèi)標(biāo)肽段)分別注入(超)高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀中檢測，通過m/z及t_R進行定性鑒別，通過色譜峰峰面積變化，采用內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法測算出樣品中牛血清白蛋白的含量。

實施例1：

樣品：牛奶

雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)

雙混合內(nèi)標(biāo)肽段

內(nèi)標(biāo)肽段1 DAFLGSFLYEYSR

內(nèi)標(biāo)肽段2 AEFVEVTK

(1)樣品的制備：取牛奶0.2ml，加入0.8ml細胞裂解液，超聲處理5min，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘渣加入雙混合內(nèi)標(biāo)肽段，加800mmol/L碳酸氫銨溶液100μL，渦旋(1000rmp)5min，加入100mmol/L二硫蘇糖醇溶液100μL，60℃溫育振蕩(1000rmp)60min，放置至室溫后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液400μL，30℃溫育振蕩(1000rmp)30min，加入1mg/ml胰蛋白酶溶液50μL，50℃溫育振蕩(1000rmp)60min，放置至室溫后，加入10％甲酸水溶液300μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終酶解產(chǎn)物。

(2)將雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測。特征肽段1的檢出限為1ng，特征肽段2的檢出限為2ng，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.03％，回收率為95.3％～100.9％(n＝6)。

實施例2：

樣品：牛奶粉

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I

特征肽段1 DAFLGSFLYEYSR

內(nèi)標(biāo)肽段1 DAFLGSFLYEYSR

單一內(nèi)標(biāo)肽段I：

內(nèi)標(biāo)肽段1 DAFLGSFLYEYSR

(1)樣品的制備：取豬肉0.1g，加入1ml細胞裂解液，加入。。。。。取牛奶粉0.2mg，加入1ml細胞裂解液，超聲處理5min，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘渣加入單一內(nèi)標(biāo)肽段I，加入400mmol/L碳酸氫銨溶液200μL，渦旋(1200rmp)2min，加入150mmol/L二硫蘇糖醇溶液30μL，65℃溫育振蕩(1200rmp)30min，放置至室溫后，加入300mmol/L碘代乙酰胺溶液50μL，30℃溫育振蕩(1200rmp)40min，加入200μg/ml胰蛋白酶溶液200μL，55℃振蕩(1500rmp)溫育45min，放置至室溫后，加入20％甲酸水溶液50μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終酶解產(chǎn)物。

(2)將單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I和最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測，檢出限為2ng，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4.24％，回收率為96.1％～101.5％(n＝6)。

實施例3：

樣品：牛肉

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)I

特征肽段1 DAFLGSFLYEYSR

1)樣品的制備：取牛肉0.1mg，加入1ml細胞裂解液，超聲破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘渣加入100mmol/L碳酸氫銨溶液25μL，渦旋(1000rmp)5min，加入150mmol/L二硫蘇糖醇溶液10μL，65℃溫育振蕩(1200rmp)60min后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液50μL，30℃溫育振蕩(1000rmp)40min，加入300μg/ml胰蛋白酶溶液100μL，35℃溫育振蕩(1500rmp)12h，放置至室溫后，加入20％甲酸水溶液50μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終酶解產(chǎn)物。

2)將單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)I和最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測，檢出限為2ng，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.94％，回收率為96.1％～101.3％(n＝6)。

實施例4：

樣品：牛肉干

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)II

特征肽段2 AEFVEVTK

內(nèi)標(biāo)肽段2 AEFVEVTK

單一內(nèi)標(biāo)肽段II

內(nèi)標(biāo)肽段2 AEFVEVTK

1)樣品的制備：取牛肉干0.1mg，加入1ml細胞裂解液，超聲破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘渣加入單一內(nèi)標(biāo)肽段II，加入10mmol/L碳酸氫銨溶液200μL，渦旋(800rmp)10min，加入1000mmol/L二硫蘇糖醇溶液30μL，70℃溫育振蕩(2000rmp)3h，放置至室溫后，加入10mmol/L碘代乙酰胺溶液50μL，25℃溫育振蕩(2500rmp)30min，加入0.1mg/ml胰蛋白酶溶液200μL，55℃振蕩(1500rmp)溫育45min，放置至室溫后，加入5％甲酸水溶液50μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終酶解產(chǎn)物。

2)將單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)II和最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測，特征肽段2的檢出限為2ng，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4.11％，回收率為95.5％～102.9％(n＝6)。

實施例5：

樣品：牛血旺

單一標(biāo)準(zhǔn)肽段I

特征肽段1 DAFLGSFLYEYSR

單一標(biāo)準(zhǔn)肽段II

特征肽段2 AEFVEVTK

單一內(nèi)標(biāo)肽段I

內(nèi)標(biāo)肽段1 DAFLGSFLYEYSR

單一內(nèi)標(biāo)肽段II

內(nèi)標(biāo)肽段2 AEFVEVTK

1)樣品的制備：取牛血旺0.1mg，加入1ml細胞裂解液，超聲破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘渣加入單一內(nèi)標(biāo)肽段I和單一內(nèi)標(biāo)肽段II，加入1000mmol/L碳酸氫銨溶液25μL，渦旋(1000rmp)6min，加入10mmol/L二硫蘇糖醇溶液10μL，65℃溫育振蕩(1200rmp)60min溫后，加入1000mmol/L碘代乙酰胺溶液50μL，30℃溫育振蕩(1000rmp)50min，加入5mg/ml胰蛋白酶溶液100μL，35℃溫育振蕩(1800rmp)10h，放置至室溫后，加入5％甲酸水溶液50μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終酶解產(chǎn)物。

2)將單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)I和II及單一內(nèi)標(biāo)肽段I和II混合，與最終酶解產(chǎn)物(含單一內(nèi)標(biāo)肽段I和II)分別注入(超)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測，檢出限為2ng，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.96％，回收率為96.1％～101.2％(n＝6)。特征肽段1的檢出限為1ng，特征肽段2的檢出限為2ng，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.11％，回收率為94.8％～98.9％(n＝6)。

實施例6：

樣品：牛肉罐頭

單一標(biāo)準(zhǔn)肽段I

特征肽段1 DAFLGSFLYEYSR

單一標(biāo)準(zhǔn)肽段II

特征肽段2 AEFVEVTK

(1)樣品的制備：取牛肉罐頭0.5mg，加入1ml細胞裂解液，超聲破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘渣加入加200mmol/L碳酸氫銨溶液400μL，渦旋(1000rmp)5min，加入100mmol/L二硫蘇糖醇溶液400μL，60℃溫育振蕩(1000rmp)60min，放置至室溫后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液400μL，30℃溫育振蕩(1000rmp)30min，加入100μg/ml胰蛋白酶溶液200μL，50℃溫育振蕩(1000rmp)60min，放置至室溫后，加入10％甲酸水溶液400μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終酶解產(chǎn)物。

(2)將單一標(biāo)準(zhǔn)肽段I和II混合，和最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測。特征肽段1的檢出限為1ng，特征肽段2的檢出限為2ng，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.01％，回收率為95.5％～101.8％(n＝6)。

實施例7：

樣品：牛血清

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I

特征肽段1 DAFLGSFLYEYSR

內(nèi)標(biāo)肽段1 DAFLGSFLYEYSR

單一內(nèi)標(biāo)肽段I：

內(nèi)標(biāo)肽段1 DAFLGSFLYEYSR

(1)樣品的制備：取牛血清0.1ml，加入1ml細胞裂解液，超聲處理5min，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘渣加入單一內(nèi)標(biāo)肽段I，加入100mmol/L碳酸氫銨溶液800μL，渦旋(1200rmp)2min，加入150mmol/L二硫蘇糖醇溶液300μL，60℃溫育振蕩(1200rmp)30min，放置至室溫后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液500μL，30℃溫育振蕩(1200rmp)40min，加入200μg/ml胰蛋白酶溶液200μL，55℃振蕩(1500rmp)溫育45min，放置至室溫后，加入20％甲酸水溶液100μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終酶解產(chǎn)物。

(2)將單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I和最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測，檢出限為2ng，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.11％，回收率為95.5％～97.3％(n＝6)。

實施例8：

樣品：酸牛奶

混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I

特征肽段1 DAFLGSFLYEYSR

特征肽段2 AEFVEVTK

內(nèi)標(biāo)肽段1 DAFLGSFLYEYSR

單一內(nèi)標(biāo)肽段I：

內(nèi)標(biāo)肽段1 DAFLGSFLYEYSR

(1)樣品的制備：取酸牛奶0.5ml，加入1ml細胞裂解液，超聲處理5min，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘渣加入單一內(nèi)標(biāo)肽段I，加150mmol/L碳酸氫銨溶液800μL，渦旋(1000rmp)5min，加入100mmol/L二硫蘇糖醇溶液400μL，60℃溫育振蕩(1000rmp)60min，放置至室溫后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液400μL，30℃溫育振蕩(1000rmp)30min，加入100μg/ml胰蛋白酶溶液500μL，50℃溫育振蕩(1000rmp)60min，放置至室溫后，加入10％甲酸水溶液300μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終酶解產(chǎn)物。

(2)將混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I和最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測。特征肽段1的檢出限為1ng，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1.91％，回收率為95.5％～96.8％(n＝6)，特征肽段2作為佐證肽段。

以上實施例中：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特征肽段單獨使用或與其他特征肽段配成兩種混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用，具體實施方式不再一一贅述。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特征肽段與其內(nèi)標(biāo)肽段配成的混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，單獨使用或與另外一種特征肽段或混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)同時使用，具體實施方式不再一一贅述。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配成單劑、雙劑或多劑，具體不再一一贅述。

所述胰蛋白酶為序列級胰蛋白酶、胰蛋白酶中的至少一種。

總之，上述替換的實施例在這里不做贅述。

總之，實驗證明，采用本發(fā)明的檢測試劑盒完全可以對樣品中牛血清白蛋白進行鑒定，并得出所需的絕對含量測定結(jié)果，并且靈敏度高、特異性好、精密度高、不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染。

本發(fā)明的檢測試劑盒及檢測方法具有專屬性強、精密度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、操作簡便等優(yōu)點，可用于樣品中牛血清白蛋白含量測定。

蛋白序列

牛血清白蛋白

MKWVTFISLLLLFSSAYSRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVLIAFSQYLQQCPFDEHVKLVNELTEFAKTCVADESHAGCEKSLHTLFGDELCKVASLRETYGDMADCCEKQEPERNECFLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKADEKKFWGKYLYEIARRHPYFYAPELLYYANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMREKVLASSARQRLRCASIQKFGERALKAWSVARLSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTISSKLKECCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPENLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFLGSFLYEYSRRHPEYAVSVLLRLAKEYEATLEECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLVDEPQNLIKQNCDQFEKLGEYGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVEVSRSLGKVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLILNRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLFTFHADICTLPDTEKQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGPKLVVSTQTALA

牛血清白蛋白

MKWVTFISLLLLFSSAYSRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVLIAFSQYLQQCPFDEHVKLVNELTEFAKTCVADESHAGCEKSLHTLFGDELCKVASLRETYGDMADCCEKQEPERNECFLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKADEKKFWGKYLYEIARRHPYFYAPELLYYANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMREKVLASSARQRLRCASIQKFGERALKAWSVARLSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTISSKLKECCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPENLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFLGSFLYEYSRRHPEYAVSVLLRLAKEYEATLEECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLVDEPQNLIKQNCDQFEKLGEYGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVEVSRSLGKVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLILNRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLFTFHADICTLPDTEKQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGPKLVVSTQTALA