一種B族維生素的檢測方法與流程

本發(fā)明涉及分析化學領域，尤其涉及一種B族維生素的檢測方法。

背景技術(shù)：

維生素是維護人體健康、促進生長發(fā)育和調(diào)節(jié)生理功能所必需的一類有機化合物。這些化合物都存在于天然食物中，一般在體內(nèi)不能合成或合成量較少，不能滿足需要。由于飲食習慣和缺乏營養(yǎng)知識，以及現(xiàn)代人生活方式改變，難以達到理想的平衡膳食模式，據(jù)權(quán)威部門調(diào)查，中國多數(shù)人日常飲食不能均衡提供某些維生素和礦物質(zhì)，缺鈣、鐵、維生素A、B2比較普遍，缺鋅、硒、維生素B₁、維生素C也很常見。因此有必要服用營養(yǎng)素補充劑。

多種維生素緩釋膠囊是通過親水凝膠骨架達到緩釋的效果，口服后遇消化液發(fā)生水化作用生成凝膠，其中的B族維生素通過擴散和凝膠骨架溶蝕的方式釋放。親水凝膠骨架不容易完全溶解，從而造成B族維生素含量測定難度大。經(jīng)試驗，目前已報道文獻的方法均不能測定多種維生素緩釋膠囊的中的維生素B₁、B₂、B₃、B₅、B₆、B₇、B₁₂。

在保健食品的生產(chǎn)、貯藏、供應和臨床使用等各個環(huán)節(jié)，為確保保健食品質(zhì)量，均需經(jīng)過嚴格的分析檢驗，以此來保證保健食品的安全有效合理。因此，進一步開發(fā)多種維生素緩釋膠囊中B族維生素的檢測方法是非常關(guān)鍵的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種B族維生素的檢測方法，本發(fā)明采用HPLC-MS聯(lián)用的方法，可實現(xiàn)對多種維生素緩釋膠囊中7種B族維生素的檢測，該方法線性范圍廣，精密度，重復性、穩(wěn)定性和靈敏度、準確性皆良好，且空白溶液對測定結(jié)果無影響。

本發(fā)明提供的B族維生素的檢測方法，以甲酸水溶液或乙酸水溶液為流動相A相；以甲醇或乙腈為流動相B相；采用高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用對樣品進行檢測，根據(jù)質(zhì)譜圖和色譜圖對B族維生素進行定性和/或定量；

所述高效液相色譜采用梯度洗脫，洗脫程序為：

0～0.5min，流動相A相的體積分數(shù)為92％；

0.5min～8min，流動相A相的體積分數(shù)由92％降至10％；

8min～8.5min，流動相A相的體積分數(shù)為10％；

8.5min～9min，流動相A相的體積分數(shù)由10％升至92％；

9min～12min，流動相A相的體積分數(shù)為92％。

高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)將HPLC對復雜樣品的分離能力與MS具有選擇性、靈敏性及能夠提供相對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的有點結(jié)合起來，在藥物、食品、保健品或環(huán)境分析等多個領域得到了廣泛的應用。但在面對需要對一種新的樣品進行檢測時，需要對HPLC-MS的條件進行摸索，以建立針對該樣品的檢測方法。新的方法需要進行精密度、重復性和準確度等多方面的鑒定，對本發(fā)明提供方法的鑒定結(jié)果表明：

線性：線性實驗結(jié)果表明，維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12的相關(guān)系數(shù)R分別為0.9999、0.9998、0.9998、0.9998、0.9998、0.9998、0.9997,所以用該方法測定維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12濃度分別為1.57343μg/ml至7.86712μg/ml，1.59031μg/ml至7.95156μg/ml，10.0300μg/ml至50.1498μg/ml，3.21878μg/ml至16.0939μg/ml，1.57642μg/ml至7.88211μg/ml，0.524892μg/ml至2.62446μg/ml，0.534886μg/ml至2.67443μg/ml，之間呈現(xiàn)良好的線性，符合GB/T27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范》的要求(GB/T27404-2008要求相關(guān)系數(shù)R≥0.99)。

精密度：同一份B族維生素標準工作溶液，連續(xù)進樣六次，7種B族維生素峰面積的相對標準偏差皆小于0.8％，說明該方法的精密度良好。

重復性：取B族維生素標準工作溶液，由同一分析人員精密稱取6份，平行操作測定6份供試品溶液，結(jié)果表明，7種B族維生素含量相對標準偏差皆小于0.9％，在規(guī)定范圍內(nèi)，說明此本發(fā)明提供方法的重復性較好。

穩(wěn)定性：將B族維生素的標準工作溶液分別在室溫下放置0h、1h、2h、4h、8h、12h后進行檢測，7種B族維生素峰面積的相對標準偏差皆小于0.7％，說明該方法的精密度良好。

空白實驗表明，對空白溶液的檢測譜圖中，在維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12的出峰時間處均無峰，表明空白對測定結(jié)果基本無干擾。

準確度：在樣品中加入已知量的標準品，以本發(fā)明提供的方法對B族維生素的進行定量，計算加樣回收率。每組濃度平行三次檢測回收率，計算平均值，結(jié)果表明，7種B族維生素回收率位于99.1％～100.1％，符合回收率要求。說明該方法具有良好的準確度。

液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達到分離的目的，因此要求流動相對樣品具有一定的溶解能力且與樣品不產(chǎn)生化學反應，其黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；且流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應。如使用紫外檢測器，則應使用對紫外吸收較低的溶劑配制。其沸點不可以太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導致實驗無法進行。對于B族維生素而言，以本發(fā)明提供的流動相進行等度洗脫能夠保證更好的檢測效果，優(yōu)于其他流動相的檢測結(jié)果。

在本發(fā)明中，甲酸水溶液中，甲酸的體積分數(shù)為0.1％；所述乙酸水溶液中，乙酸的體積分數(shù)為0.1％。

一些具體實施例中，流動相A相為體積分數(shù)為0.1％的甲酸水溶液。

在另一些實施例中，流動相A相為體積分數(shù)為0.1％的乙酸水溶液。

在本發(fā)明中，高效液相色譜流動相的流速為0.3mL/min～0.5mL/min。

一些具體實施例中，高效液相色譜流動相的流速為0.5mL/min。

對柱溫的選擇需考慮待分離物質(zhì)本身的特性，柱溫影響流動相對待測物質(zhì)的溶解度也會影響柱壓。一般情況下，提高柱溫有利于提高分離度，但溫度過高會導致柱壓過低，不利于物質(zhì)的檢出。

本發(fā)明中，高效液相色譜的色譜柱的柱溫為30℃～40℃。

一些具體實施例中，高效液相色譜的色譜柱的柱溫為40℃。

高效液相色譜的進樣量為1～5μL，優(yōu)選為2μL。

對本發(fā)明提供的方法而言，根據(jù)B族維生素的極性選擇C18色譜柱。色譜柱的尺寸會對分離結(jié)果產(chǎn)生影響，其內(nèi)徑會對流動相的流速產(chǎn)生影響，長度較短的色譜柱運行時間短，柱壓較低；長度較長的色譜柱分辨率稿，但運行時間增長。

本發(fā)明中，高效液相色譜的色譜柱為C18色譜柱，尺寸為100×4.6mm，2.6μm；150×4.6mm，2.7μm或100×4.6mm，3μm。

一些實施例中，色譜柱為Phenomenex,Kinetex,XB-C18,(100×4.6mm，2.6μm)；Agilent,EC-C18,(150×4.6mm，2.7μm)；或Phenomenex,Luna,C18(2),(100×4.6mm，3μm)。

一個具體實施例中，色譜柱為Phenomenex,Kinetex,XB-C18,(100×4.6mm，2.6μm)。

本發(fā)明中，質(zhì)譜的離子源為電噴霧正離子源；離子源溫度為600℃。

本發(fā)明中，質(zhì)譜的電噴霧電壓為5500V；碰撞氣壓7.0psi；氣簾氣壓22.0psi；霧化氣壓60.0psi；輔助氣流速20.0psi。

對不同B族維生素的檢測參數(shù)如表1：

表1質(zhì)譜參數(shù)

其中，母離子(Q1)、定量定性離子對(Q3)、去簇電壓(DP)、入口電壓(EP)、碰撞池入口電壓(CEP)、碰撞氣能量(CE)、碰撞室出口電壓(CXP)。

樣品的前處理方式對檢測結(jié)果同樣影響顯著，不當?shù)那疤幚頃е聶z測失敗。

本發(fā)明樣品進樣前經(jīng)前處理，所述前處理的方式為：以水為溶劑對粉碎后的樣品進行超聲提取，經(jīng)離心后過濾除菌；所述超聲提取的時間為20～40min；溫度為10～30℃功率為0.8～1.1KW，頻率為37～45KHz。

前處理過程中，水與樣品的質(zhì)量-體積比為(90mg～180mg)：(500mL～1000mL)。

超聲的時間為30min。

離心的轉(zhuǎn)速為8000r/min；時間為4～8min。優(yōu)選離心5min。

離心后取上清液過濾除菌，濾徑為0.22μm。

本發(fā)明提供的檢測方法在對保健品中B族維生素檢測中的應用。

本發(fā)明提供方法適用的保健品為多種維生素緩釋膠囊。

所述多種維生素緩釋膠囊中輔料包括：海藻酸鈉、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮。

實驗表明，采用本發(fā)明提供的方法對多種維生素緩釋膠囊進行檢測，其中的輔料成分的檢出峰不會對B族維生素產(chǎn)生干擾，本發(fā)明提供的方法具有良好的準確性、精密度、穩(wěn)定性和重復性。

附圖說明

圖1～7依次示維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12的標準曲線；

圖8～14依次示維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12的標品與純凈水的色譜圖對比；其中圖8-a～圖14-a示維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12的標品的色譜圖，圖8-b～圖14-b示純凈水的色譜圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種B族維生素的檢測方法，本領域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明采用的儀器和試劑皆為普通市售品，皆可于市場購得。

其中：

儀器為安捷倫1260高效液相色譜儀-API3200質(zhì)譜儀(配ESI離子源)。

試劑試藥：甲酸(色譜純)；甲醇(色譜純)；一級用水；維生素B1-硝酸硫胺素(來源：SUPELCO，批號:LB84083V，純度:99.9％)；維生素B2-核黃素(來源：Dr.，批號:31106，純度:98.9％)；維生素B3-煙酰胺(來源：SUPELCO，批號:LC01839V，純度:99.9％)；維生素B5-泛酸鈣(來源：SUPELCO，批號:LC11592V，純度:99.9％)；維生素B6-鹽酸吡哆醇(來源：SUPELCO，批號:LB83988V，純度:99.9％)；維生素B7-生物素(來源：中國食品藥品檢定研究院，批號:100291-201303，純度:99.6％)；維生素B12-鈷胺素(來源：中國食品藥品檢定研究院，批號:100248-201203，純度:90.2％)。

下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：

實施例1

高效液相色譜儀條件：

流動相：A：0.1％甲酸溶液，B：甲醇，梯度洗脫；

流速：0.5ml/min；

柱溫：40℃；

色譜柱：Phenomenex,Kinetex,XB-C18，100×4.6mm，2.6μm。

質(zhì)譜參數(shù)如表1：

表1質(zhì)譜參數(shù)

離子源溫度為600℃，質(zhì)譜的電噴霧電壓為5500V；碰撞氣壓7.0psi；氣簾氣壓22.0psi；霧化氣壓60.0psi；輔助氣流速20.0psi。

分別精密稱取硝酸硫胺素5.25mg，核黃素5.36mg，煙酰胺5.02mg，泛酸鈣5.37mg，鹽酸吡哆醇5.26mg，生物素5.27mg，鈷胺素5.93mg，分別置于50ml棕色容量瓶中，加入水溶解并定容至刻度，搖勻，即得儲備液。儲備液放在4℃的冰箱中儲存?zhèn)溆谩?注：核黃素需先加少量鹽酸溶液溶解后，再加水定容。)

分別精密吸取硝酸硫胺素儲備液3.00ml，核黃素儲備液3.00ml，煙酰胺儲備液20.00ml，泛酸鈣儲備液6.00ml，鹽酸吡哆醇儲備液3.00ml，生物素儲備液1.00ml，鈷胺素儲備液1.00ml，置于100ml棕色容量瓶中，加入水定容至刻度，搖勻，即得工作溶液，分別精密吸取工作溶液1μl、2μl、3μl、4μl、5μl，進行分析測定，繪制標準工作曲線。結(jié)果如表2：

表2：試驗數(shù)據(jù)

線性評價：維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12的相關(guān)系數(shù)R分別為0.9999、0.9998、0.9998、0.9998、0.9998、0.9998、0.9997,所以用該方法測定維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12濃度分別為1.57343μg/ml至7.86712μg/ml，1.59031μg/ml至7.95156μg/ml，10.0300μg/ml至50.1498μg/ml，3.21878μg/ml至16.0939μg/ml，1.57642μg/ml至7.88211μg/ml，0.524892μg/ml至2.62446μg/ml，0.534886μg/ml至2.67443μg/ml，之間呈現(xiàn)良好的線性，符合GB/T27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范》的要求【GB/T27404-2008要求相關(guān)系數(shù)R≥0.99】。

實施例2

分別精密吸取硝酸硫胺素儲備液3.00ml，核黃素儲備液3.00ml，煙酰胺儲備液20.00ml，泛酸鈣儲備液6.00ml，鹽酸吡哆醇儲備液3.00ml，生物素儲備液1.00ml，鈷胺素儲備液1.00ml，置于100ml棕色容量瓶中，加入水定容至刻度，搖勻，即得工作溶液，

將維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12的標準工作溶液按實施例1條件重復測定6次，計算其峰面積RSD(％)。結(jié)果如表3：

表3：精密度

維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12重復測定6次峰面積的RSD分別為0.5％、0.8％、0.7％、0.8％、0.6％、0.7％、0.7％，表明該方法有較好的精密度。

實施例3

精密稱取6份多種維生素緩釋膠囊中維生素B族緩釋片的樣品粉末180mg，置于50ml離心管中，精密加入50.00ml水超聲攪拌溶解，約30min，放冷至室溫，8000r/min離心5min，經(jīng)0.22μm的水相濾膜過濾，即得測定供試液。進樣2μl，按實施例1檢測條件檢測樣品含量，

樣品含量計算公式為：

X＝C×V/M×K

式中：X—樣品中維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12的含量，g/100g；

M—樣品的質(zhì)量，g；

K—單位轉(zhuǎn)換系數(shù)(K＝0.0001)；

V—樣品的稀釋倍數(shù)，ml；

C—樣品溶液中維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12的濃度，μg/ml。

注：泛酸鈣轉(zhuǎn)化成泛酸的系數(shù)0.92，計算泛酸對照溶液濃度時需乘上。

計算其峰面積RSD(％)。結(jié)果如表4：

表4重復性

6份樣品維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12含量的RSD分別為0.7％、0.8％、0.9％、0.8％、0.8％、0.6％、0.7％，表明該方法有較好的重復性，符合GB/T27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范》的要求【GB/T27404-2008要求RSD(％)≤2.7％】。

實施例4

分別精密吸取硝酸硫胺素儲備液3.00ml，核黃素儲備液3.00ml，煙酰胺儲備液20.00ml，泛酸鈣儲備液6.00ml，鹽酸吡哆醇儲備液3.00ml，生物素儲備液1.00ml，鈷胺素儲備液1.00ml，置于100ml棕色容量瓶中，加入水定容至刻度，搖勻，即得工作溶液。將工作溶液分別在室溫下放置0h、1h、2h、4h、8h、12h后，按實施例1檢測條件測定峰面積，計算其RSD(％)。結(jié)果如表5：

表5穩(wěn)定性

維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12標準工作溶液分別在室溫下放置0h、1h、2h、4h、8h、12h后，RSD分別為0.5％、0.7％、0.7％、0.6％、0.6％、0.7％、0.7％，表明維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12標準工作溶液在室溫下12小時內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

實施例5

取純凈水作為檢測樣品，將純凈水經(jīng)超聲30min后，經(jīng)0.22μm的水相濾膜過濾，即得完全釋放的供試液。進樣2μl。與維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12標準工作溶液的出峰時間對比。結(jié)果如圖8～14。

結(jié)果表明，空白溶液在維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12的出峰時間處均無峰，表明空白對測定結(jié)果基本無干擾。

實施例6

分析方法檢出限由信噪比(S/N)計算。當信噪比(S/N)為3時，檢出限為維生素B1:0.62937ng/ml；維生素B2:0.63612ng/ml；維生素B3:4.01198ng/ml；維生素B5:1.28751ng/ml；維生素B6:0.63057ng/ml；維生素B7:10.49780ng/ml；維生素B12:10.69770ng/ml。

實施例7

加標：精密稱取約0.18g樣品9份(已知樣品的維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12含量分別為：1.215％、1.066％、11.948％、2.732％、1.218％、0.528％、2.526mg/100g)，分成3組，每組3份，各組分別精密加入硝酸硫胺素，核黃素，煙酰胺，泛酸鈣，鹽酸吡哆醇，生物素，鈷胺素適量。

將待測樣品置于50ml離心管中，精密加入50.00ml水超聲攪拌溶解，約30min，放冷至室溫，8000r/min離心5min，經(jīng)0.22μm的水相濾膜過濾，進樣2μl。按實施例1檢測條件測定峰面積，計算其RSD(％)。

測得加入量＝加標樣品測得量-樣品測得量

回收率(％)＝測得加入量/理論加入量

結(jié)果如表6：

表6回收率

維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12的平均回收率分別為：99.1％、99.3％、99.3％、99.8％、100.1％、99.3％、99.5％、，相對標準偏差(RSD)分別為0.8％、0.7％、0.8％、0.6％、0.6％、0.6％、0.5％，符合GB/T27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范》的要求【GB/T27404-2008要求回收率為95—105％】。

通過對維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12的含量測定方法進行線性、精密度、重復性、穩(wěn)定性、空白、檢出限、回收率試驗，均符合GB/T27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范》的要求，證明含量測定方法科學有效，能對多種維生素緩釋膠囊的維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12含量起到質(zhì)量控制的目的。

以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術(shù)領域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。