本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域，具體說是涉及一種判別煙草代謝組學(xué)中新鮮煙葉樣品質(zhì)量是否滿足代謝組學(xué)研究需要的判別方法。
背景技術(shù)：
：植物代謝組學(xué)是通過考察植物受刺激或擾動(dòng)后期代謝產(chǎn)物的變化或其隨時(shí)間的變化，來研究植物體的一種技術(shù)。在代謝組學(xué)輪廓分析的流程中，典型樣品的采集是首要并且極其重要的步驟，獲得合格樣品，以真實(shí)客觀的反映樣品的代謝狀態(tài)，是代謝組學(xué)分析進(jìn)行的基礎(chǔ)和前提。植物鮮葉樣品的采集，需要在低溫下淬滅以停止其生理活動(dòng)以保證其停止在采樣時(shí)的代謝狀態(tài)，標(biāo)準(zhǔn)做法為采摘植物樣品后，錫紙包裹，置于-196℃液氮冷凍，用于新鮮煙葉分析或者凍干后用干粉樣品分析。在樣品采摘到分析前的這一段過程，需保證新鮮煙葉在液氮中保存且在液氮條件下研磨，否則會(huì)造成煙葉的酶促褐變。煙葉中色素含量與煙葉品質(zhì)密切相關(guān)。一方面煙葉外觀品質(zhì)（如顏色）與煙葉色素含量直接相關(guān)；另一方面色素，尤其是胡蘿卜素作為煙草香氣成分重要的前體物質(zhì)，對煙草的香氣質(zhì)和香氣量有直接作用。有研究表明，類胡蘿卜素是烤煙致香成分的重要前體，在煙葉中性香味成分中，有很大一批化合物是類胡蘿卜素的降解產(chǎn)物，如巨豆三烯酮、氧化異佛爾酮、β-大馬酮、β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯等都是煙草中特別重要的香味物質(zhì)。然而褐變的煙葉樣品，其顏色會(huì)由鮮綠變?yōu)楹稚?，但酶促褐變反?yīng)輕微的樣品僅通過觀察樣品外觀顏色深淺難以準(zhǔn)確判別樣品是否正常。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提正是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中所存在的不足之處而供一種對煙草代謝組學(xué)中新鮮煙葉樣品質(zhì)量進(jìn)行判別的方法。本發(fā)明利用新鮮煙葉中胡蘿卜素與葉綠素b含量的比值對代謝組學(xué)研究中的新鮮煙葉質(zhì)量進(jìn)行判別，為代謝組學(xué)研究的樣品質(zhì)量判別提供依據(jù)，該法操作簡單快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本發(fā)明的目的可通過下述技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)：本發(fā)明的基于色素的煙草代謝組學(xué)中新鮮煙葉樣品質(zhì)量的判別方法通過檢測新鮮煙葉中胡蘿卜素與葉綠素b含量，計(jì)算其比值，對煙草代謝組學(xué)中新鮮煙葉樣品質(zhì)量進(jìn)行判別；具體步驟如下：a、稱取新鮮煙葉凍干樣品0.2~0.4g，加入25~50mL萃取劑，冰浴下超聲波萃取20~40min，取萃取液經(jīng)0.45μm微膜過濾器過濾，濾液裝入棕色色譜瓶，待HPLC分析；b、液相色譜的條件為：色譜柱WatersNova-Pak-C18（3.9×150mm，4μm）；柱溫30℃；柱流速0.5mL/min；進(jìn)樣量10μL；流動(dòng)相A：異丙醇；流動(dòng)相B：80％乙腈的水溶液（V/V）；平衡時(shí)間6min；梯度洗脫：0min，100%B；40min，0%B；葉綠素b檢測波長428nm，其它質(zhì)體色素檢測波長為448nm；采用保留時(shí)間結(jié)合標(biāo)樣的吸收光譜定性，外標(biāo)法定量；c、通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出胡蘿卜素和葉綠素b的含量。本發(fā)明中所述新鮮煙葉凍干樣品為大田采摘的新鮮煙葉，經(jīng)-196℃液氮罐保存運(yùn)輸，液氮冷凍研磨并凍干后，在-80℃冰箱保存待用的煙葉末；所述萃取劑是濃度為90%的丙酮溶液。本發(fā)明以胡蘿卜素與葉綠素b含量的比值為指標(biāo)，建立區(qū)分代謝組學(xué)正常樣品及褐化樣品的標(biāo)準(zhǔn)，即待測樣品中胡蘿卜素與葉綠素b含量的比值在0.19以上的為合格樣品，用于煙草代謝組學(xué)分析，胡蘿卜素與葉綠素b含量的比值在0.19以下的為變質(zhì)的不合格樣品，不可用于煙草代謝組學(xué)分析。本發(fā)明的有益效果如下：經(jīng)過大量新鮮煙葉樣品的分析研究，發(fā)現(xiàn)新鮮煙葉如果發(fā)生酶促褐變等反應(yīng)，其色素的含量會(huì)發(fā)生較大變化，胡蘿卜素與葉綠素b含量的比值明顯降低，此樣品將不能用于代謝組學(xué)分析，因此以胡蘿卜素與葉綠素b含量的比值作為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)對煙草代謝組學(xué)中新鮮煙葉樣品質(zhì)量進(jìn)行判別。相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有操作簡單快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、樣品用量少的優(yōu)點(diǎn)，可為煙草代謝特征分析及相關(guān)煙草代謝組學(xué)研究提供借鑒。具體實(shí)施方式本發(fā)明以下將結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步說明：實(shí)施例1采用HPLC方法測定新鮮煙葉樣品中的色素含量，發(fā)現(xiàn)褐化樣品的胡蘿卜素與葉綠素b含量比值明顯降低。待測樣品包括福建、貴州、湖南、河南、云南等省份的7個(gè)品種、20個(gè)產(chǎn)地的新鮮煙葉樣品127份（每個(gè)點(diǎn)有5-7個(gè)生物學(xué)重復(fù)）。其中包括92份合格樣品（樣品在采集、運(yùn)送及預(yù)處理過程中均嚴(yán)格控制在-80℃），35份褐變樣品（由于儲(chǔ)運(yùn)過程中液氮不足等原因已完全褐變）。樣品分析步驟如下所述：1）由大田采摘的新鮮煙葉，于-196℃液氮罐保存運(yùn)輸，液氮冷凍研磨，低溫凍干，-80℃冰箱保存待后續(xù)進(jìn)行代謝組學(xué)分析。準(zhǔn)確稱取新鮮煙葉凍干樣品0.2g左右（精確至0.1mg）于50mL三角瓶中，準(zhǔn)確加入25mL萃取劑（濃度為90%的丙酮溶液），冰浴下超聲波萃取20min，取適量萃取液經(jīng)0.45μm微膜過濾器過濾。濾液裝入2mL棕色色譜瓶，待HPLC分析。2）液相色譜的條件為：色譜柱WatersNova-Pak-C18（3.9×150mm，4μm）；柱溫30℃；柱流速0.5mL/min；進(jìn)樣量10μL；流動(dòng)相A：異丙醇；流動(dòng)相B：80％乙腈的水溶液（V/V）；平衡時(shí)間6min；梯度洗脫：0min，100%B；40min，0%B。葉綠素b檢測波長428nm，其它質(zhì)體色素檢測波長為448nm。采用保留時(shí)間結(jié)合標(biāo)樣的吸收光譜定性，外標(biāo)法定量。繪制了胡蘿卜素（36.42min，0.10-5.0μg/mL）與葉綠素b（27.24min，0.5-10.0μg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以不同濃度下的峰面積響應(yīng)進(jìn)行回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y（胡蘿卜素）=375.53X-1.31，Y（葉綠素b）=80.62X+3.07，相關(guān)系數(shù)分別為0.9997和0.9991。表1實(shí)施例1中煙葉樣品信息及胡蘿卜素與葉綠素b含量的比值樣品編號(hào)產(chǎn)地品種重復(fù)數(shù)胡蘿卜素/葉綠素b是否合格HZ10河南許昌中煙10050.04-0.06不合格C23Y貴州畢節(jié)云9760不合格HK10河南許昌K32660.13-0.16不合格C07C福建龍巖云8760不合格C24B貴州黔南貴煙2號(hào)60不合格C29K湖南張家界K32660不合格C01K云南昆明K32650.22-0.25合格C02K云南玉溪K32660.32-0.34合格C03C云南曲靖云8760.26-0.29合格C04Y云南紅河云9760.29-0.32合格C05Y云南普洱云8760.25-0.33合格C06Y云南大理云8750.23-0.25合格C09Y貴州黔西南云9760.25-0.28合格C12C河南平頂山中煙10060.32-0.35合格C13C河南南陽中煙10050.24-0.27合格C14C河南駐馬店中煙10060.23-0.26合格C15K廣東韶關(guān)K32660.25-0.29合格C17K湖南郴州K32660.25-0.27合格C25N貴州銅仁南江3號(hào)60.26-0.30合格C26Y湖北恩施云8760.31-0.40合格YH10云南大理紅花大金元50.22-0.24合格GK10貴州遵義K32660.24-0.29合格經(jīng)過以上實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重質(zhì)變（褐化）樣品中的胡蘿卜素與葉綠素b含量的比值顯著降低。本發(fā)明將胡蘿卜素與葉綠素b含量的比值作為區(qū)分代謝組學(xué)正常樣品和變質(zhì)的不合格樣品的標(biāo)準(zhǔn)。即待測樣品中胡蘿卜素與葉綠素b含量的比值在0.19以上的為合格樣品，可用于煙草代謝組學(xué)分析，胡蘿卜素與葉綠素b含量的比值在0.19以下的為變質(zhì)的不合格樣品，不可用于代謝組學(xué)分析。當(dāng)前第1頁1 2 3