一種測(cè)定卷煙主流煙氣中TSNAs含量的方法與流程

本發(fā)明屬于卷煙煙氣分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及卷煙煙氣有害成分的檢驗(yàn)，特別是卷煙主流煙氣中特有TSNAs含量的測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

煙草特有TSNAs(TSNAs)主要包括N-亞硝基降煙堿(NNN)、4-(甲基TSNAs基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亞硝基假木賊堿(NAB)和N-亞硝基新煙堿(NAT)等。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)、Hecht研究團(tuán)隊(duì)等，加拿大政府名單中有害成分的毒性評(píng)價(jià)結(jié)果表明，且有足夠的證據(jù)認(rèn)為，TSNAs中的NNK對(duì)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物有致癌性。近年，國家煙草專賣局組織實(shí)施的“卷煙危害性指標(biāo)體系研究”項(xiàng)目也表明，在卷煙煙氣的實(shí)際環(huán)境下，對(duì)人體影響最大的7種有害化學(xué)成分指標(biāo)中，NNK是其中之一。

目前，卷煙主流煙氣中TSNAs的檢測(cè)方法主要有氣相色譜-熱能分析法(GC-TEA)、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC–MS)和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)。GC-TEA法作為CORESTA推薦的主流煙氣中TSNAs的檢測(cè)方法，使用的最為廣泛。但是GC-TEA方法的樣品前處理過程復(fù)雜，選擇性較差?，F(xiàn)行最為流行的LC-MS/MS法一般選取醋酸銨水溶液萃取，然后直接上樣分析，方法簡(jiǎn)單，但是對(duì)于TSNAs含量較低的中式烤煙型卷煙的測(cè)定較為困難，特別是含量最低的NAB，測(cè)定較為困難。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于此，本發(fā)明目的在于提供一種前處理相對(duì)簡(jiǎn)單、靈敏度更高、分析速度快的TSNAs含量檢測(cè)方法，該方法專用于分析卷煙主流煙氣中TSNAs含量。

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是，提供一種測(cè)定卷煙主流煙氣中煙草特有亞硝胺含量的方法，包括以下步驟：

步驟a)煙氣捕集

選取玻璃纖維濾片捕集卷煙主流煙氣；

步驟b)提取目標(biāo)物

將捕集過主流煙氣的濾片放入萃取管，加入萃取液和內(nèi)標(biāo),將第一離心管置于第一渦旋振蕩儀，渦旋振蕩，靜置；所述萃取管為離心管；

步驟c)凈化

吸取上清液于第二離心管，加入陶瓷均質(zhì)子、硫酸鎂和N-丙基乙二胺，將第二離心管置于第二渦旋振蕩儀，渦旋振蕩，離心；上清液經(jīng)有機(jī)相濾膜過濾，濾液待測(cè)；

步驟d)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

用甲醇配置TSNAs標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于棕色玻璃瓶中，低溫保存；量取儲(chǔ)備液用甲醇稀釋定容，制得TSNAs工作液；

用甲醇準(zhǔn)確配置TSNAs-d4內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，用內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液配制內(nèi)標(biāo)工作液，并儲(chǔ)存于棕色玻璃瓶中；所有的儲(chǔ)備液低溫保存，使用前將其恢復(fù)到室溫；

用萃取液配制不同濃度的TSNAs標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；

步驟e)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定

吸取配制好的不同濃度的TSNAs標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注入U(xiǎn)PLC-MS/MS系統(tǒng)，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算出樣品待測(cè)液中TSNAs含量。

根據(jù)本發(fā)明測(cè)定卷煙主流煙氣中煙草特有亞硝胺含量的方法的一個(gè)實(shí)施方式，所述步驟a)中，捕集主流煙氣的濾片直徑為44mm。

根據(jù)本發(fā)明測(cè)定卷煙主流煙氣中煙草特有亞硝胺含量的方法的一個(gè)實(shí)施方式，所述步驟b)中，第一離心管為50mL，加入100mmol/L的萃取液15mL和1μg/mL混合內(nèi)標(biāo)150μL；所述萃取液為醋酸銨水溶液。

根據(jù)本發(fā)明測(cè)定卷煙主流煙氣中煙草特有亞硝胺含量的方法的一個(gè)實(shí)施方式，所述步驟b)中，所述第一渦旋振蕩儀的渦旋振蕩時(shí)間為5min，渦旋振蕩轉(zhuǎn)速為2000轉(zhuǎn)/min。

根據(jù)本發(fā)明測(cè)定卷煙主流煙氣中煙草特有亞硝胺含量的方法的一個(gè)實(shí)施方式，所述步驟c)中，第二離心管為2mL，移取的上清液為1mL,加入陶瓷均質(zhì)子兩顆，加入的無水硫酸鎂和N-丙基乙二胺分別為150mg和25mg。

根據(jù)本發(fā)明測(cè)定卷煙主流煙氣中煙草特有亞硝胺含量的方法的一個(gè)實(shí)施方式，所述步驟c)中，所述第二渦旋震蕩儀的渦旋振蕩時(shí)間為2min，渦旋振蕩轉(zhuǎn)速為2000轉(zhuǎn)/min。

根據(jù)本發(fā)明測(cè)定卷煙主流煙氣中煙草特有亞硝胺含量的方法的一個(gè)實(shí)施方式，所述步驟c)中，離心時(shí)間為4min，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為6000轉(zhuǎn)/min。

根據(jù)本發(fā)明測(cè)定卷煙主流煙氣中煙草特有亞硝胺含量的方法的一個(gè)實(shí)施方式，所述步驟e)具體操作為：吸取配制好的不同濃度的TSNAs標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注入U(xiǎn)PLC-MS/MS系統(tǒng)，繪制TSNAs的線性回歸方程，對(duì)純化稀釋后的樣品待測(cè)液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測(cè)液中分析物的含量。

根據(jù)本發(fā)明測(cè)定卷煙主流煙氣中煙草特有亞硝胺含量的方法的一個(gè)實(shí)施方式，所述步驟d)中，UPLC-MS/MS系統(tǒng)的色譜條件：選用色譜柱為C18，規(guī)格為100mm×2.1mm，1.7μm；流動(dòng)相A：0.1％甲酸水和流動(dòng)相B：甲醇；梯度洗脫條件為：0～0.5min，80％A～80％A；0.5～1.0min，80％A～10％A；1.0～2.9min，10％A～10％A；2.9～3.5min，10％A～80％A；3.51～5.0min，80％A～80％A；流動(dòng)相流速為0.6mL/min。

根據(jù)本發(fā)明測(cè)定卷煙主流煙氣中煙草特有亞硝胺含量的方法的一個(gè)實(shí)施方式，所述步驟d)中，串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)的條件為：電噴霧離子源，噴霧電壓(IS)3.0kV；離子化溫度450℃；霧化氣流量800L/Hr；錐孔氣流量50L/Hr；碰撞氣為氬氣，流量0.15ml/min；其余氣體為氮?dú)?；駐留時(shí)間為100msec，正離子MRM模式采集。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述技術(shù)方案中的一個(gè)技術(shù)方案具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1、與傳統(tǒng)的GC-TEA檢測(cè)方法比較，采用醋酸銨萃取，渦旋振蕩，過濾進(jìn)樣的方式，簡(jiǎn)化了前處理過程，提高了分析靈敏度。

2、與現(xiàn)有的LC-MS/MS方法相比，用渦旋振蕩法振蕩時(shí)間明顯短于超聲萃取或振蕩萃取，提取效率增加，振蕩時(shí)間縮短了6倍。

3、與現(xiàn)有的LC-MS/MS方法相比，選取了分散固相萃取凈化主流煙氣樣品，有利于低TSNAs含量的烤煙型卷煙的測(cè)定。

4、本發(fā)明選取了超高效液相色譜柱，使得柱子的分離度明顯提高，分析時(shí)間顯著縮短，提高檢測(cè)通量。串聯(lián)質(zhì)譜的使用使得方法的選擇性和靈敏度提高，更有利于吸煙者主流煙氣中低含量TSNAs的測(cè)定。

5、本發(fā)明使用內(nèi)標(biāo)為氘代內(nèi)標(biāo)，使用氘代內(nèi)標(biāo)定量，有效消除基質(zhì)干擾和前處理過程中引起的誤差。

6、本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度及重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1是振蕩萃取-LC-MS/MS法檢測(cè)1號(hào)烤煙樣品中TSNAs的選擇離子流色譜圖。

圖2是本發(fā)明檢測(cè)1號(hào)烤煙樣品中TSNAs的選擇離子流色譜圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)例做進(jìn)一步描述。

本實(shí)施例所用儀器與試劑為：Waters Xevo TQ超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司)，配備電噴霧電離源(ESI)；VtexMixer 230VeU振蕩器(美國Labnet公司)。

甲酸為HPLC級(jí)(濃度為49-51％，德國Sigma公司)；乙腈、甲醇均為色譜純(美國Thermo-Fisher公司)；TSNAs，TSNAs-d₄(純度：98％；同位素純度：99％，Toronto Research Chemicals Inc.)，水為超純水。

本發(fā)明采用醋酸銨水溶液為萃取液，渦旋振蕩萃取，基質(zhì)分散萃取凈化，氘代內(nèi)標(biāo)定量，UPLC-MS/MS測(cè)定等步驟對(duì)主流煙氣中TSNAs進(jìn)行測(cè)定，可快速、準(zhǔn)確、同時(shí)檢測(cè)出主流煙氣中4種TSNAs的含量，即N-亞硝基降煙堿(NNN)、4-(甲基TSNAs基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亞硝基假木賊堿(NAB)和N-亞硝基新煙堿(NAT)的含量。

1、主流煙氣捕集

根據(jù)《卷煙：取樣》(ISO 8243:2006)來選取樣品煙支,按照《煙草和煙草制品調(diào)節(jié)和試驗(yàn)用大氣》(ISO 3402:1999)來平衡煙支；采用《常規(guī)分析卷煙吸煙機(jī).定義和標(biāo)準(zhǔn)條件》(ISO 3308:2000)來捕集卷煙主流煙氣。

2、提取主流煙氣中的分析物

取捕集過卷煙主流煙氣的濾片，放入50mL具塞離心管，加入15mL 100mmol/L醋酸銨萃取液，并加入150μL 1μg/mL氘代混合內(nèi)標(biāo)，在2000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下渦旋振蕩5min，取1mL上清液于2mL旋蓋離心管中，加入150mg無水硫酸鎂和25mgPSA，在2000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下渦旋振蕩2min，在6000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心4min。上清液過0.22μm有機(jī)相濾膜，取5μL濾液引入LC-MS/MS分離分析。

3、UPLC-MS/MS測(cè)定

(1)UPLC-MS/MS條件：

色譜條件：Atiantis UPLC BEH C18(100mm×2.1mm，1.7μm，美國Waters公司)；流動(dòng)相A：0.1％甲酸水和流動(dòng)相B：甲醇；梯度洗脫條件為：0～0.5min，80％A～80％A；0.5～1.0min，80％A～10％A；1.0～2.9min，10％A～10％A；2.9～3.5min，10％A～80％A；3.51～5.0min，80％A～80％A；流動(dòng)相流速為0.6mL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，噴霧電壓(IS)3.0kV；離子化溫度450℃；霧化氣流量800L/Hr；錐孔氣(cone)流量50L/Hr；碰撞氣流量為0.15ml/min；碰撞氣為氬氣，其余氣體為氮?dú)猓获v留時(shí)間為100msec，正離子MRM模式采集，監(jiān)測(cè)離子對(duì)及其相應(yīng)的碰撞能量(CE)見表1。

表1多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下四種煙草特有TSNAs及其氘代內(nèi)標(biāo)的部分質(zhì)譜參數(shù)

*定量離子對(duì)。

(2)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

儲(chǔ)備液及工作液的配制：用甲醇準(zhǔn)確配制11.00μg/mL NNN，11.20μg/mL NNK，10.14μg/mL NAB，5.00μg/mL NAT標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存。量取各化合物儲(chǔ)備液進(jìn)行混合，配制得到1μg/mL TSNAs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

用甲醇配制100μg/mL NNN-d₄，50μg/mL NAT-d₄，100μg/mL NAB-d₄和250μg/mL NNK-d₄的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存。準(zhǔn)確量取的各內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，混合后配成1μg/mL混合內(nèi)標(biāo)溶液。

(3)TSNAs含量的測(cè)定：

吸取配制好的不同濃度的TSNAs的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各5μL，注入U(xiǎn)PLC-MS/MS；TSNAs的線性回歸方程見表2，方程中y代表分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，x表示主流煙氣中目標(biāo)分析物的濃度。同樣的方法檢測(cè)實(shí)際樣本，求得實(shí)際樣本中TSNAs的含量。

(4)該方法的線性范圍和檢出限

本實(shí)施例以空白烤煙基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別移取1μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0μL，10μL，20μL,50μL,100μL，200μL，500μL和800μL于8個(gè)10mL棕色容量瓶中，每個(gè)容量瓶移入100μL 1μg/mL氘代混合內(nèi)標(biāo)工作液，用甲醇定容至10mL。各標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度分別為0ng/mL，1ng/mL，2ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL和80ng/mL。對(duì)各標(biāo)樣峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積的比值(y)和其濃度(x)進(jìn)行線性回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。各種化合物線性關(guān)系良好(相關(guān)系數(shù)r²≥0.99),可以滿足定量分析的需要。以3倍信噪比確定方法的檢出限,詳見表2。

表2 TSNAs的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限及保留時(shí)間

(5)本發(fā)明方法的重復(fù)性和加標(biāo)回收率：

在主流煙氣樣品萃取過程中添加一定量的TSNAs標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后提取、測(cè)定，計(jì)算回收率。本實(shí)驗(yàn)選用高、中、低3種不同濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)來考察方法的準(zhǔn)確度，除了較低含量的NAB在加入量為10.1ng時(shí)的回收率為82.5％之外，其它點(diǎn)的回收率都在90％-95％之間。方法的精密度以回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來評(píng)價(jià)，對(duì)同一樣品平行測(cè)定5次，3種化合物回收率的RSD范圍為4.9％～9.8％，結(jié)果見表3。

表3主流煙氣中TSNAs的回收率和精密度(n＝5)

(6)本發(fā)明方法與傳統(tǒng)的超聲萃取方法的比較：

傳統(tǒng)的LC-MS/MS測(cè)定主流煙氣的TSNAs主要是選取回旋振蕩或者超聲萃取30min,我們選取了四個(gè)樣品，兩個(gè)烤煙型樣品，兩個(gè)混合型樣品，盒標(biāo)焦油量范圍為3mg-11mg，分別用傳統(tǒng)的超聲萃取方法和本發(fā)明的渦旋振蕩基質(zhì)分散固相萃取方法進(jìn)行比對(duì)，每個(gè)樣品測(cè)定6

個(gè)平行，通過回歸分析顯示兩種方法的NNN,NNK,NAB和NAT相關(guān)系數(shù)分別為0.983,0.930,0.835和0.996,四個(gè)指標(biāo)都顯著相關(guān)(P<0.001),測(cè)定結(jié)果見表4，兩種方法的相關(guān)性分析的結(jié)果見表5。振蕩萃取-測(cè)定LC-MS/MS測(cè)定1號(hào)烤煙型卷煙主流煙氣中TSNAs的選擇離子流色譜圖如圖1所示，同一樣品中采用本方法處理測(cè)定主流煙氣的TSNAs的選擇離子流色譜圖如圖2所示，從圖中可以看出，本發(fā)明由于加入簡(jiǎn)單的凈化步驟后，目標(biāo)分析物的響應(yīng)增強(qiáng)，干擾物明顯降低。表4采用振蕩萃取的LC-MS/MS方法和本發(fā)明方法測(cè)定四種卷煙的檢測(cè)數(shù)據(jù)

注：A,B為烤煙型卷煙，C,D為混合型卷煙。

表5振蕩萃取-LC-MS/MS方法和本發(fā)明方法測(cè)定數(shù)據(jù)的回歸分析

以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，上述優(yōu)選實(shí)施方式不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以權(quán)利要求所限定的范圍為準(zhǔn)。對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。