一種恩格列凈及其光學異構(gòu)體的分離測定方法與流程

本發(fā)明屬于藥物分析方法領域，具體涉及一種采用高效液相色譜法分離測定降糖藥恩格列凈及其光學異構(gòu)體的方法。

背景技術(shù)：

恩格列凈為一種選擇性鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白(SGLT)抑制劑，用于治療成人II型糖尿病。恩格列凈通過對鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白選擇性抑制作用，限制了大部分葡萄糖在體內(nèi)的重吸收，促使葡萄糖大量從尿中排出達到控制血糖水平的目的。

恩格列凈的化學結(jié)構(gòu)式如下：

其化學名為：(1S)-1,5-脫水-1-C-[4-氯-3-[[4-[[(3S)-四氫-3-呋喃基]氧基]苯基]甲基]苯基]-D-葡萄糖醇。

恩格列凈結(jié)構(gòu)中有6個手性中心，在其合成反應過程中在部分手性中心的位置易產(chǎn)生相應的光學異構(gòu)體副產(chǎn)物，殘留后直接影響藥物的純度和質(zhì)量。光學異構(gòu)體A、B的化學結(jié)構(gòu)式如下：

目前，有關恩格列凈及其光學異構(gòu)體測定方法未見報道，為保證恩格列凈的質(zhì)量可控，以確保其有效性和安全性，亟需一種有效的檢測方法，能夠分離測定恩格列凈及其光學異構(gòu)體。本發(fā)明人經(jīng)過大量的科學試驗和測試條件的篩選，發(fā)現(xiàn)一種快速分離測定恩格列凈及其光學異構(gòu)體的方法，該方法可以有效控制恩格列凈的光學異構(gòu)體雜質(zhì)，從而完成了本發(fā)明。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，已上市的恩格列凈片劑，其中含有的乳糖、微晶纖維素等藥用輔料在本發(fā)明的方法中不會干擾測定恩格列凈及其光學異構(gòu)體的測定。因此，本發(fā)明同樣適用于恩格列凈的藥物組合物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在本發(fā)明的目的在于提供一種恩格列凈及其光學異構(gòu)體的分離測定方法，該方法能將恩格列凈與其光學異構(gòu)體有效分離，準確檢測恩格列凈原料藥和其藥物組合物中的光學異構(gòu)體，從而控制恩格列凈的質(zhì)量，確保恩格列凈藥品的有效性和安全性。

為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，提供如下實施方案。

在一實施方案中，本發(fā)明提供了一種用高效液相色譜法分離測定恩格列凈及其光學異構(gòu)體的方法，包括以直鏈淀粉衍生物手性柱為色譜柱，以甲醇、乙醇和正己烷的混合物作為流動相，或者,以纖維素衍生物手性柱為色譜柱，以乙腈與磷酸鹽緩沖溶液的混合物作為流動相，進行洗脫，以紫外檢測器進行檢測。

優(yōu)選的，上述本發(fā)明的方法，所述直鏈淀粉衍生物手性柱為直鏈淀粉-三（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）鍵合硅膠填料柱，所述纖維素衍生物手性柱為纖維素-三（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）鍵合硅膠填料柱；流動相中，甲醇、乙醇與正己烷的體積比為16∶11：73，乙腈與磷酸鹽緩沖溶液的體積比為25∶75～65∶35，更優(yōu)選乙腈與磷酸鹽緩沖溶液的體積比為45∶55，所述磷酸鹽緩沖溶液的pH值為2～6，所述磷酸鹽選自磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸二氫銨、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀和磷酸氫二銨中的一種或多種，優(yōu)選為磷酸二氫鈉；用磷酸調(diào)節(jié)pH。

上述本發(fā)明的方法，進一步包括以下步驟：

本發(fā)明的方法，進一步包括以下步驟：

（1）取恩格列凈原料藥或其藥物組合物，加甲醇、乙醇或乙腈使恩格列凈完全溶解并稀釋定容，配制成每1ml溶液中含恩格列凈0.8～2.0mg，優(yōu)選1.5mg,濾過，作為供試品溶液；

（2）以直鏈淀粉或纖維素衍生物類手性柱為色譜柱，柱溫為25～35℃，優(yōu)選30℃，波長為200～250nm，優(yōu)選為224 nm；

（3）取供試品溶液5～20μl，優(yōu)選10μl，注入高效液相色譜儀，以適當流速洗,優(yōu)選0.8-1ml/min脫完成恩格列凈及其光學異構(gòu)體的分離測定。

在一具體實施方案中，本發(fā)明的一種用高效液相色譜分離測定恩格列凈及其光學異構(gòu)體的方法，其具體包括以下步驟：

（1）取恩格列凈原料藥或制劑，精密稱定，加甲醇、乙醇或乙腈適量使恩格列凈溶解，再用溶劑稀釋制成每1ml中含恩格列凈0.8～2.0mg的溶液，必要時濾過，作為供試品溶液；

（2）色譜條件如下：以直鏈淀粉-三（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）鍵合硅膠填料柱為色譜柱，以甲醇、乙醇和正己烷的混合溶劑組成流動相進行洗脫，其中，甲醇、乙醇與正己烷的體積比為16∶11：73，或者以纖維素-三（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）鍵合硅膠填料柱為色譜柱，以乙腈和磷酸二氫鈉緩沖液(用磷酸調(diào)pH值至2～6)的混合液作為流動相，混合進行洗脫，其中，乙腈和磷酸二氫鈉緩沖液的體積比為45∶55，柱溫為：30℃；檢測波長為224nm。

（3）取供試品溶液10μl，注入高效液相色譜儀，以0.8-1ml/min流速洗脫完成恩格列凈及其光學異構(gòu)體的分離測定。

本發(fā)明的方法，有益效果或優(yōu)勢在于：

①專屬性強，恩格列凈其他工藝雜質(zhì)不會干擾光學異構(gòu)體A和B的測定，可提供恩格列凈單個光學異構(gòu)體的定量結(jié)果；

②靈敏度高，本發(fā)明中光學異構(gòu)體A和B雜質(zhì)的最低檢測濃度分別為0.52μg/ml和0.92μg/ml，表明其能夠保證檢出微量的上述雜質(zhì)；

③耐用性好，選用本發(fā)明中提到的不同類型色譜柱，或者將色譜條件中流動相比例、流速、柱溫等參數(shù)在本發(fā)明所述范圍內(nèi)波動，不會對檢測結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。

總之，本發(fā)明的分離測定恩格列凈及其光學異構(gòu)體的方法，可以實現(xiàn)恩格列凈與其光學異構(gòu)體的分離分析，且方法擁有較好的專屬性、靈敏度和準確度等優(yōu)點。

附圖說明

圖1：溶劑空白的高效液相色譜圖；

圖2：恩格列凈原料藥供試品溶液的高效液相色譜圖；

圖3：恩格列凈光學異構(gòu)體A、B對照品溶液的高效液相色譜圖；

圖4： 向恩格列凈中加入光學異構(gòu)體A、B的供試品溶液的高效液相色譜圖；

圖5：不含恩格列凈僅含輔料成分的組合物空白溶液的高效液相色譜圖；

圖6：含恩格列凈的藥物組合物供試品溶液的高效液相色譜圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明。

實施例1

儀器與條件

高效液相色譜儀：Agilent 1260；

色譜柱：直鏈淀粉衍生物類手性柱（CHIRALCEL IF，4.6×250mm，5μm）；

流動相：甲醇-乙醇-正己烷（16∶11∶73）

進樣體積：10μl；

流速：1ml/min；

柱溫：30℃；

檢測波長：224nm。

實驗步驟

取恩格列凈原料藥約15mg，精密稱定，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。取溶劑（流動相）和供試品溶液，在上述色譜條件下進行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，見圖1、圖2。結(jié)果表明溶劑不干擾恩格列凈的檢測，方法專屬性好。

實施例2

儀器與條件

高效液相色譜儀：Agilent 1260；

色譜柱：直鏈淀粉衍生物類手性柱（CHIRALCEL IF，4.6×250mm，5μm）；

流動相：甲醇-乙醇-正己烷（16∶11∶73）

進樣體積：10μl；

流速：1ml/min；

柱溫：30℃；

檢測波長：224nm。

實驗步驟

取恩格列凈光學異構(gòu)體A、B各適量，精密稱定，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再定量稀釋制成每1ml中含A、B各7.5μg/ml的溶液，作為對照品溶液。取對照品溶液，在上述色譜條件下進行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，見圖3。結(jié)果表明恩格列凈光學異構(gòu)體A、B間能良好分離，光學異構(gòu)體A、B的峰高合適，方法專屬性好，靈敏度佳。

實施例3

儀器與條件

高效液相色譜儀：Agilent 1260；

色譜柱：直鏈淀粉衍生物類手性柱（CHIRALCEL IF，4.6×250mm，5μm）；

流動相：甲醇-乙醇-正己烷（16∶11∶73）

進樣體積：10μl；

流速：1ml/min；

柱溫：30℃；

檢測波長：224nm。

實驗步驟

取恩格列凈原料藥約15mg，精密稱定，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解，再加入恩格列凈光學異構(gòu)體A、B各適量，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1ml中含恩格列凈1.5mg，含光學異構(gòu)體A、B各7.5μg/ml的溶液，作為混合溶液。取混合溶液，在上述色譜條件下進行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，見圖4。結(jié)果表明恩格列凈與其光學異構(gòu)體A、B均能良好分離。

實施例4

儀器與條件

色譜柱：纖維素衍生物類手性柱（CHIRALCEL OZ-RH，4.6×150mm，5μm）；

流動相：乙腈-0.01mol/L磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調(diào)pH值至4）（45∶55）

進樣體積：10μl；

流速：0.8ml/min；

柱溫：30℃；

檢測波長：224nm。

實驗步驟

取恩格列凈原料藥約10mg，精密稱定，置10ml容量瓶中，加乙腈溶解，再加入恩格列凈光學異構(gòu)體A、B各適量，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，制成每1ml中含恩格列凈1mg，含光學異構(gòu)體A、B各5μg/ml的溶液，作為混合溶液。取混合溶液，在上述色譜條件下進行高效液相色譜分析，記錄色譜圖。結(jié)果恩格列凈與其光學異構(gòu)體A、B均能良好分離，結(jié)果表明該纖維素衍生物類手性柱與上述直鏈淀粉衍生物類手性柱能夠達到類似的分離效果。

實施例5

儀器與條件

色譜柱：直鏈淀粉衍生物手性柱（CHIRALCEL IF，4.6×250mm，5μm）；

流動相：甲醇-乙醇-正己烷（16∶11∶73）

進樣體積：10μl；

流速：1ml/min；

柱溫：30℃；

檢測波長：224nm。

實驗步驟

取恩格列凈原料藥粗品約15mg，精密稱定，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。取供試品溶液，在上述色譜條件下進行高效液相色譜分析，記錄色譜圖。結(jié)果粗品中各雜質(zhì)峰均不干擾恩格列凈光學異構(gòu)體A、B的測定，方法專屬性好。

實施例6

儀器與條件

高效液相色譜儀：Agilent 1260；

色譜柱：直鏈淀粉衍生物類手性柱（CHIRALCEL IF，4.6×250mm，5μm）；

流動相：甲醇-乙醇-正己烷（16∶11∶73）

進樣體積：10μl；

流速：1ml/min；

柱溫：30℃；

檢測波長：224nm。

實驗步驟

取恩格列凈藥物組合物適量，含恩格列凈15mg，精密稱定，置10ml容量瓶中，加甲醇適量，超聲10分鐘，使恩格列凈完全溶解，再稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取等量的不含恩格列凈只含輔料的組合物，精密稱定，置10ml容量瓶中，加甲醇超聲10分鐘，再稀釋至刻度，搖勻，作為空白溶液。取空白溶液和供試品溶液，在上述色譜條件下進行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，見圖5、圖6。結(jié)果表明輔料組合物不干擾恩格列凈及其光學異構(gòu)體的檢測。

以上所述的實施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行描述，并非對本發(fā)明的范圍進行限定，在不脫離本發(fā)明設計精神的前提下，本領域普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案做出的各種變形和改進，均應落入本發(fā)明權(quán)利要求書確定的保護范圍內(nèi)。