本發明屬于免疫檢測分析技術領域，涉及一種基于化學發光法的septin9檢測試劑盒。
背景技術：
Septin是一個廣泛存在于除植物以外所有真核生物中的基因家族。最初認為septin家族是與酵母細胞胞質分裂相關的基因家族，然而隨著研究的深入，人們發現這類基因編碼的蛋白在許多生物體內出現了較大的功能分化，尤其是在哺乳動物中，他們不僅成員眾多，而且參與了細胞分裂、細胞極化、囊泡運輸及胞膜重構等多個過程。更引起研究人員重視的是：最近有大量的數據表明，這一家族的一些成員與腫瘤發生、神經功能障礙和病原微生物感染的過程直接相關。
SEPT9定位于染色體17q25.3，該染色體區段是散發性卵巢癌和乳腺癌的常見雜合性丟失部位。在卵巢癌，約70％的17q等位基因丟失為17q25。Kalikin等以17個微衛星標記確定了卵巢癌17q的最小缺失區，并克隆到了一個候選腫瘤抑制基因，命名為，arian/breast(Ov/Br)septin蛋白(即SEPT9)。但是，新近研究又支持SEPT9為潛在原癌基因。在PyV-mT過渡表達所致的乳腺癌，SKY和CGH檢測發現17q25.3區有擴增，RT-PCR證實有SEPT9基因表達上調，9個乳腺癌細胞系中表達也上調。SEPT9表達上調的乳腺癌細胞系Thsp-1和Bax下調，細胞凋亡受抑制。siRNA抑制septin 9表達后，細胞凋亡抑制效應解除。7287例人新鮮組織和292個人細胞系的Affymetrix HG_U133基因芯片檢測結果的分析表明，SEPT9在乳腺、中樞神經系統、子宮內膜、腎臟、肝、肺、淋巴、食管、卵巢、胰腺、軟組織、皮膚、甲狀腺等來源的腫瘤中高表達，RT-PCR與免疫組織化學染色的結果大致與芯片結果一致。最近前列腺癌細胞系體內外實驗研究發現，MSF-(SEPT9-vla)可以通過抑制缺氧誘導因子1a(hypo-xia-inducible factor-，HIF1a)的泛素化降解途徑，從而促進HIF1a的表達，并促進腫瘤血管形成。該研究為septin家族在腫瘤發生、發展中的作用提供了直接證據。
Septin9蛋白是一個潛在的重要的腫瘤標志物，但是目前檢測septin9蛋白的方法復雜且昂貴，因此，需要一種準確快速定量的檢測方法滿足科學研究已經臨床的需要。本發明提供的人septin9酶聯免疫試劑盒，可以快速準確的檢測人血液、組織液等體液中的septin9的含量。
技術實現要素：
本發明提供一種基于化學發光法的septin9檢測試劑盒。該試劑盒具有檢測靈敏度高，特異性強，操作簡單，穩定性好，無污染，重復性好的特點。
一種基于化學發光法的septin9檢測試劑盒，主要包括：
(1)包被有septin9單克隆抗體的磁微粒試劑；
(2)辣根過氧化物酶標記的septin9抗體；
(3)Septin9校準品；
(4)Septin9質控品
(5)發光底物液；
(6)樣本稀釋液；
(7)濃縮洗滌液；
(8)反應杯。
所述磁微粒試劑為含有包被有septin9單克隆抗體的磁微粒和穩定劑的溶液。
所述校準品及質控品為含有一定量septin9抗原的BSA緩沖液。所述septin9標準品溶液6瓶，0ng/ml，0.3ng/ml，0.9ng/ml，2.7ng/ml，8.1ng/ml，24.3ng/ml，1ml/瓶。
所述發光底物液為含有魯米諾、過氧化氫、對碘苯酚的Tris緩沖液。
所述濃縮清洗液為含有Tris、NaCl和表面活性劑的緩沖液。
所述樣本稀釋液為含有BSA的溶液。
本發明還提供一種基于化學發光法的septin9檢測試劑盒制備方法。主要包括磁微粒包被抗體、HRP標記抗體、發光底物液配制、校準品、質控品、濃縮清洗液和樣本稀釋液配制。
步驟1，磁微粒包被抗體
采用表面含有羧基的磁微粒，用EDC活化微球表面的羧基，然后加入一定量的septin9抗體偶聯，偶聯完畢加入淬滅液消除剩余的活化的羧基，然后用BSA封閉微球表面剩余的位點。
步驟2，HRP標記septin9抗體
采用改良的過碘酸鈉法偶聯HRP和septin9抗體，在低pH條件下用NaIO4氧化HRP形成醛化酶，加入septin9抗體后醛化酶與抗體的氨基相連，然后用硼氫化鈉還原生成穩定的酶標記抗體。標記完畢用含10％BSA pH 7.4的0.05M PBS作為酶結合物稀釋液，將酶結合物稀釋到所需比例。
步驟3，發光底物液的配制
將魯米諾、過氧化氫、對碘苯酚用pH 8.5 0.05M Tris溶液溶解。
步驟4，相關溶液配制
稱取一定量septin9標準品用空白血清稀釋成如下濃度0ng/ml，0.3ng/ml， 0.9ng/ml，2.7ng/ml，8.1ng/ml，24.3ng/ml，分裝后2-8℃保存。
濃縮清洗液為含有Tris、NaCl和Tween80的緩沖液。
樣本稀釋液為含有BSA的pH7.4 0.05M PBS溶液。
本發明還提供一種人腎損傷分子(septin9)磁微粒化學發光免疫檢測試劑盒檢測流程。主要包括：
步驟1，樣品前處理
采用正確醫用技術收集全血標本，37℃靜置1h，離心分離提取血清1h后用于檢測。
血清樣本如果有渾濁或可見物，3000rpm離心5min，取上層清液即可。血清樣本收集后室溫放置不可超過8h，存放于2-8℃應不超過48h，若長期保存應存放于-20℃。
步驟2，實驗前準備
將所有試劑平衡至室溫，取出一次性平底試管和磁分離器，打開水浴鍋調節溫度為37℃，準備化學發光儀，并仔細閱讀儀器說明書。將試劑盒中各試劑混勻，磁微粒試劑混勻后應為均勻懸濁液，無明顯凝集。
步驟3，檢測過程
(1)加樣與第一步免疫反應：在每一個平底試管中加入15ul校準品或質控品、待測樣本，30ul磁微粒試劑，混勻后37℃溫育5min；
(2)洗滌：將平底試管在磁分離器上靜置2min，然后弧線傾倒上清液，將試管及磁分離器一同倒置在吸水紙上拍干，每管中加入300ul清洗液，混勻后，將平底試管在磁分離器上靜置2min，然后弧線傾倒上清液，將試管及磁分離器一同倒置在吸水紙上拍干，重復兩次；
(3)第二步免疫反應：在每一個平底試管中加入30ul酶標septin9抗體，混勻后37℃溫育5min；
(4)洗滌：將平底試管在磁分離器上靜置2min，然后弧線傾倒上清液，將試管及磁分離器一同倒置在吸水紙上拍干，每管中加入300ul清洗液，混勻后，將平底試管在磁分離器上靜置2min，然后弧線傾倒上清液，將試管及磁分離器一同倒置在吸水紙上拍干，重復兩次；
(5)加入發光底物液：每個試管加入200ul發光底物；
(6)讀取發光值：用化學發光儀測定每管的發光值。
(7)注意事項：如遇到高值hook樣本，為了避免出現高值hook效應，檢驗臨床檢測時根據其余指標選擇合適的稀釋倍數對樣品進行稀釋。
本發明的有益效果：
1.使用磁珠為固相，使免疫反應更接近液相，反應更充分和迅速，而且使結合的免疫復合物更加容易分離，降低了非特異吸附。
2.使用的化學發光底物液，使檢測的靈敏度得到了提高，而且線性范圍更 寬。
具體實施方式
實施例1磁微粒試劑制各
1.取一個干凈的1.0L容量瓶，加入700ml純化水。稱取Tris 6.02g、疊氮鈉0.99g、硫酸新霉素0.99g、四環素0.03g、BSA4.97g加入到純化水中，混勻，室溫攪拌至固體藥品完全溶解。量取Tween 20 2.76ml加入到上述溶液中攪拌均勻。用1.0M鹽酸調節pH至8.0，用純化水定容至1L，用0.22um濾膜過濾，存儲于4℃.
2.將直徑0.1um的四氧化三鐵微球用戊二醛進行活化，室溫均勻4h后，用0.01M pH7.4PBS清洗三次，并用該溶液進行懸浮，濃度為50-100mg/ml；然后每毫升懸液中加入septin9抗體100ug，于37℃混勻溫育3-8h，用等體積的含5％BSA的0.01M pH7.4PBS于37℃封閉40min，最后，用含0.5％BSA的0.02M pH 8.0Tris緩沖液清洗三次，并用上述磁珠緩沖液配制一定濃度的工作液。
實施例2辣根過氧化物標記抗體
采用改良過碘酸鈉法。以標記20mg單抗為例：準確稱取HRP 40mg，加入0.2M pH5.6醋酸緩沖液2ml，溶解后加入0.06M NaIO4溶液2ml，室溫反應20min。加入0.16M乙二醇-10％NaCl溶液2ml，室溫反應20min，將酶液裝入透析袋中，對0.001M pH4.0醋酸鹽緩沖液透析過夜；加入2M pH 9.6碳酸鹽緩沖液0.8ml，加入septin9特異性單抗II 20mg，4℃攪拌反應2h；加入新配制的5mg/ml NaBH4溶液0.4ml，4℃攪拌反應2h；滴加飽和硫酸銨溶液9.2ml，4℃攪拌反應30min，4℃3500rpm離心20min，棄上清，將沉淀溶于2ml 0.02M pH7.4的磷酸鹽緩沖液，用0.02M pH7.4的磷酸鹽緩沖液透析24h，加2ml甘油，混勻后-20℃保存。
實施例3發光底物液的配制
取一個干凈的1.0L容量瓶，加入700ml純化水。稱取Tris 6.02g、魯米諾5g、過氧化氫5ml、對碘苯酚2g加入到純化水中，混勻，室溫攪拌至固體藥品完全溶解。量取Tween 20 2.76ml加入到上述溶液中攪拌均勻。用1.0M鹽酸調節pH至8.0，用純化水定容至1L，用0.22um濾膜過濾，存儲于4℃。
實施例4校準品、質控品、濃縮清洗液、樣品稀釋液配制
稱取一定量septin9標準品用空白血清稀釋成如下濃度0ng/ml，0.3ng/ml，0.9ng/ml，2.7ng/ml，8.1ng/ml，24.3ng/ml，分裝后2-8℃保存。
濃縮清洗為0.2M PBST溶液。
樣本稀釋液：加入500ml純化于容器中，稱取Tris 6g、NaCl18.8g、BSA 60g、Proclin300 1ml，調節pH至7.5。純化水定容至1L，過濾保存。
實施例5人腎損傷分子(septin9)磁微粒化學發光免疫檢測試劑盒檢測流程
1、樣品前處理
采用正確醫用技術收集全血標本，37℃靜置1h，離心分離提取血清1h后用于檢測。
血清樣本如果有渾濁或可見物，3000rpm離心5min，取上層清液即可。血清樣本收集后室溫放置不可超過8h，存放于2-8℃應不超過48h，若長期保存應存放于-20℃。
2、實驗前準備
將所有試劑平衡至室溫，取出一次性平底試管和磁分離器，打開水浴鍋調節溫度為37℃，準備化學發光儀，并仔細閱讀儀器說明書。將試劑盒中各試劑混勻，磁微粒試劑混勻后應為均勻懸濁液，無明顯凝集。
3、檢測過程
(1)加樣與第一步免疫反應：在每一個平底試管中加入15ul校準品或質控品、待測樣本，30ul磁微粒試劑，混勻后37℃溫育5min；
(2)洗滌：將平底試管在磁分離器上靜置2min，然后弧線傾倒上清液，將試管及磁分離器一同倒置在吸水紙上拍干，每管中加入300ul清洗液，混勻后，將平底試管在磁分離器上靜置2min，然后弧線傾倒上清液，將試管及磁分離器一同倒置在吸水紙上拍干，重復兩次；
(3)第二步免疫反應：在每一個平底試管中加入30ul酶標septin9抗體，混勻后37℃溫育5min；
(4)洗滌：將平底試管在磁分離器上靜置2min，然后弧線傾倒上清液，將試管及磁分離器一同倒置在吸水紙上拍干，每管中加入300ul清洗液，混勻后，將平底試管在磁分離器上靜置2min，然后弧線傾倒上清液，將試管及磁分離器一同倒置在吸水紙上拍干，重復兩次；
(5)加入發光底物液：每個試管加入200ul發光底物；
(6)讀取發光值：用化學發光儀測定每管的發光值。
注意事項：如遇到高值hook樣本，為了避免出現高值hook效應，檢驗臨床檢測時根據其余指標選擇合適的稀釋倍數對樣品進行稀釋。
實施例6試劑盒性能指標
1試劑盒最低檢出限
本實施例檢測本發明試劑盒的檢出限。具體操作為：抽取一盒試劑盒，按照實施例2的方法檢測樣品稀釋液，重復檢測20次，計算檢測發光值的平均值(M)和標準差(SD)，計算M-2SD的值，將M-2SD對應的發光值代入標準曲線，計算所得到的濃度值即為試劑盒檢出限，經過驗證本試劑盒的檢出限為0.01ng/ml。
2試劑盒特異性
本實施例檢測本發明試劑盒的特異性。具體操作為：抽取一盒試劑盒，按照實施例2的方法檢測100ng/ml NAGL、100ng/mlC反應蛋白、100ng/ml胱抑素C，檢測結果應小于0.1ng/ml。
3試劑盒重復性
本實施例檢測本發明試劑盒的重復性。具體操作為：抽取一盒試劑盒，按照實施例2的方法檢測濃度為1.0ng/ml的標準品溶液，重復檢測10次。計算測定結果的平均濃度和標準差(S)，按照公式(1)計算變異系數(CV)，CV應不高于10％。
4試劑盒的劑量-反應曲線的線性
本實施例檢測本發明試劑盒的劑量-反應曲線的線性。具體操作為：抽取一盒試劑盒，按照實施例2的方法檢測濃度為檢測濃度為0ng/ml，0.3ng/ml，0.9ng/ml，2.7ng/ml，8.1ng/ml，24.3ng/ml的septin9測定樣品液，每個濃度檢測2支，記錄各濃度水平的測量結果，并計算各濃度水平兩次測量值的平均值(yi)，以濃度值(xi)為自變量，以測定結果均值(yi)為因變量求出線性回歸方程。按公式(2)計算線性回歸的相關系數(r)，r應≥0.975。其中為5個濃度值的平均值；為測量值的平均值。
5試劑盒穩定性
本實施例檢測本發明試劑盒的穩定性。具體操作為：將試劑盒2-8℃下放置1年，分別在第1、2、3、6、8、12、15個月檢測，其檢出限、特異性、重復性、劑量-反應曲線的線性應符合要求。