氣道上皮與氣道平滑肌細胞共培養裝置的制造方法
【技術領域】
[0001]本實用新型涉及細胞培養實驗器材，具體地說涉及一種氣道上皮與氣道平滑肌細胞共培養裝置。
【背景技術】
[0002]氣道平滑肌原代培養是體外研究氣道重塑的重要手段之一，也是對哮喘等氣道慢性炎癥性疾病進行細胞分子水平研究的基礎。建立氣道平滑肌細胞和氣道上皮細胞共培養模型對研究呼吸系統疾病，特別是氣道上皮細胞的損傷、炎癥對平滑肌細胞增生、肥大的作用尤為重要。
[0003]目前存在的氣道上皮和氣道平滑肌細胞共培養的裝置主要是Transwell小室。Transwell小室的底部濾膜材質為聚苯二甲酸乙二醇酯(polythylene terephthalate，PET)，膜表面經過鈦酸酯偶聯劑(titanate coupling agent，TC)處理，改善了細胞的貼壁性；另外，插入式細胞培養皿包含有透明的B1pore膜，可直接透過膜觀察細胞。利用插入式培養皿可將氣道上皮細胞或氣道平滑肌細胞接種于可通透性的PET膜上，直徑為12 mm和30 mm的插入式細胞培養皿可懸掛于24孔或6孔板上，其原理是將氣道上皮細胞和氣道平滑肌細胞在同一培養基中的兩個層面上進行培養，兩種細胞分泌的各種細胞因子和營養物質可以通過插入式培養皿的微孔膜在細胞間進行交換。插入式培養皿為懸掛式設計，方便移液管操作，而且插入皿會自動歸位。
[0004]但上述Transwell小室存在以下缺陷:(I) Transwell小室中，生長于不同層面的氣道上皮細胞和氣道平滑肌細胞通過濾膜進行對話，并不符合實際生理情況。(2)尤其在共培養的短期作用觀察中，Transwell小室的濾膜在一定程度上，不利于細胞因子和營養物質的迅速擴散和相互交流，導致介質分布不均，影響細胞間對話。(3) Transwell小室的PET材質濾膜，孔徑一般較小，最大不超過12 ym，僅有少數細胞可以通過，由于濾膜本身面積有限，且氣道上皮細胞系較氣道平滑肌原代細胞生長迅速，因此，濾膜上的氣道上皮細胞常會累積生長，導致位于內層的氣道上皮細胞氧氣、營養物質獲取不足；氣道上皮細胞和氣道平滑肌細胞的生長狀態難以協調一致。(4) Transwell小室費用較貴，難以應用于大規模、大批次的細胞共培養。
【實用新型內容】
[0005]發明目的:本實用新型的目的是提供一種低成本、建立培養體系簡捷有效、且便于后續實驗操作的氣道上皮與氣道平滑肌細胞共培養裝置。
[0006]技術方案:為實現上述目的，本實用新型的氣道上皮與氣道平滑肌細胞共培養裝置包括:設有至少一個皿狀空間的容器、設于所述容器皿狀空間底面的若干根立柱、以及對應任一皿狀空間內被立柱穩定在某一水平高度的尼龍網。
[0007]所述容器包括但不限于6孔板、12孔板、24孔板、細胞培養皿的任意一種。優選地，所述容器為12孔板。
[0008]任一皿狀空間內的立柱設有3~6個。本實用新型的立柱是根據實際需要手動安裝在容器底壁的，立柱與尼龍網形成一個氣道上皮細胞和氣道平滑肌細胞的共培養體系。所述若干根立柱為底部熔融狀態下焊接在皿狀空間底面的玻璃柱，立柱的高度不超出皿狀空間高度的1/3~1/2。
[0009]氣道平滑肌細胞種植于容器皿狀空間的底壁，氣道上皮細胞種植于尼龍網上。培養時整個體系在培養基中，立柱需要方便設置且利于尼龍網的取出。所述若干根立柱距其頂端1/4~1/3處設有與所述尼龍網間隙配合的橫向切槽。進一步地，在任一皿狀空間內，立柱切槽的槽口方向面向皿狀空間的中心，所述尼龍網為圓形尼龍網。
[0010]所述尼龍網為300目~600目尼龍網，優選為400目尼龍網，原因主要是:(I)尼龍網為柔性材料，方便細胞培養過程中用鑷子夾取和卡在切槽內。(2)尼龍網同時具有一定韌性和表面摩擦力，卡在切槽內的尼龍網不會下沉和漂浮。(3)氣道上皮細胞直徑一般十幾微米，不超過40 μ m，300目~600目尼龍網的直徑在23~48 μ m之間，其中400目尼龍網直徑為38μπι左右；氣道上皮細胞具有貼壁性強和生長速度快的特性，選擇網眼直徑略大于氣道上皮細胞的尼龍網，有利于細胞貼壁生長和自由穿越，同時有利于營養物質的滲透。
[0011]利用本實用新型的培養裝置建立氣道上皮細胞和氣道平滑肌細胞培養體系的處理步驟包括:
[0012](I)玻璃柱酸處理后進行高壓滅菌，然后焊接到孔板內底面；
[0013](2)冷卻后將焊接有玻璃柱的孔板紫外消毒，多聚賴氨酸包被，37° C過夜；
[0014](3)將氣道平滑肌細胞種植于孔板內底面，48 h后全量換液，以后每2~3 d換液一次；
[0015](4)氣道平滑肌細胞種植第3 d，尼龍網75%酒精浸泡30 min，紫外消毒，多聚賴氨酸包被，37° C過夜；
[0016](5)離體培養2~4 d氣道上皮細胞系種植于尼龍網，24 h后全量換液，以后每2~3d換液一次；
[0017](6)氣道平滑肌細胞種植第5 d，條件培養基預孵氣道上皮細胞系24 h，收集條件培養基；次日，條件培養基半量更換平滑肌細胞培養基，37° C孵育24 h ;
[0018](7)氣道平滑肌細胞種植第7~9 d，更換新鮮平滑肌細胞培養基，將氣道上皮細胞系尼龍網小心反扣并卡在玻璃柱切槽內，建立體系。
[0019]有益效果:(1)本實用新型設計合理、操作簡便、易行，克服了 Transwell小室氣道上皮細胞生長不易控制的問題。利用300目~600目尼龍網，可減緩上皮細胞生長速度，且上皮細胞可自由穿越尼龍網的兩面進行生長，防止因復層累積生長導致內層細胞營養不良。(2)本實用新型改良了 Transwell小室，氣道上皮細胞和氣道平滑肌細胞生長在同一細胞外液的不同平面上，氣道上皮細胞和氣道平滑肌細胞分泌的各種細胞因子和營養物質可以相互交換；同時通過反扣尼龍網，可以使氣道上皮細胞與氣道平滑肌細胞直接對話，相對于Transwell小室通過濾膜進行分子生物交換，更直接、更接近于生理情況。(3)本實用新型應用過程中