通常情況相比需要更少的可溶性因子。
[01%] 肝臟生物基質支架中完整血管系(vascular化ees)的表征:大鼠肝臟生物基質支 架中脈管包括毛細血管網絡的分支(branching)和網狀(ramifying)基質殘留物分別通過 光顯微鏡和巧光顯微鏡可視化。將若丹明標記的250kDa葡聚糖顆粒通過口靜脈的殘留物注 射到肝臟生物基質支架中，W檢查生物基質支架中脈管系統的基質殘留物的完整性。使用 Le i caMZl 6FA巧光解剖顯微鏡(機動化)準備影片。
[0127] 人胎兒肝臟處理：由認證機構（Advanced Biological Resources，San 化ancisco，CA)從通過選擇妊娠終止獲得的16-20周胎齡的胎兒提供胎兒肝臟組織。該研究 方案由北卡羅來納查佩爾山大學的針對人研究的機構審查委員會審查和批準。人胎兒肝臟 細胞的懸浮液如先前描述地進行制備 48'49。簡要的說，在補充0.1%牛血清白蛋白、lnM砸和 抗生素的RPMI 1640中進行處理。酶處理緩沖液含有300U/ml IV型膠原酶和0.3mg/ml脫氧 核糖核酸酶，其在32°C頻繁攬拌15-20分鐘。將富集的緩沖液擠壓通過75規格網，并W 1200RPM旋轉5分鐘，然后再懸浮。通過臺吩藍排除法評估的細胞存活力通常高于95%。
[0128] h化SC的富集和在生物基質支架上的培養:我們使用兩種方法用于WlpSC的純化或 富集：
[0129] 1)培養選擇:將大約3 X IO5細胞鋪板在IOcm組織培養皿和KM中。每S天更換培養 液。5-7天內形成集落并觀察最長達3個月。我們在14-18天后使用倒置顯微鏡（1X-FLAIII; Olympus ,Japan 和 Melville, NY)手動挑選集落。
[0130] 2)使用Miltenyi Biotech MACS系統（Bergisch Gla化ach，德國）遵照廠商說明書 通過使用磁珠免疫選擇技術選擇針對上皮細胞粘附分子化PCAM和CD326)為陽性的細胞而 實現專能肝祖細胞亞群（multipotent hepatic progenitor subpopulations，hHpSC和 h皿)的磁性免疫選擇w。簡要的說，在4°C，將解離的細胞與結合至磁性微珠的化CAM抗體解 育30分鐘，并使用來自Miltenyi的磁柱分離系統遵照廠商推薦程序進行分離。
[01川用250hHpSC集落、或5X105富集的hHpSC或2.5X105的原代成體肝細胞接種培養 物。每日更換培養液，并且所收集的培養液在-20°C下保存用于進一步分析。在包被I型膠原 的24孔培養板上培養的細胞作為對照。
[0132] 成體大鼠肝細胞分離:大鼠肝細胞的新鮮分離懸浮液從3個月大、重200-250g的成 體雄性LewiS大鼠（化arIes River Laboratories ,Wilmington，MA)獲得。使用如先前所述 的改進兩步灌注法49用于大鼠肝細胞分離和純化。用含有EGTA的無巧緩沖液灌注肝臟10-15 分鐘，然后在含有膠原酶的含巧緩沖液中灌注10-15分鐘。然后通過擠壓消化的肝臟穿過紗 布并隨后繼續將細胞懸浮液通過狹窄網格尺寸的篩網來機械地解離肝臟。細胞清洗兩次并 然后在50g離屯、。通過在臺吩藍染色后計數細胞來定義存活力。通常，每只大鼠分離200-300 百萬細胞，存活力為89-96%，純度為>99%。
[0133] 成體肝細胞分離和培養:從Cel IzDirect (現在是Invihogen, RTP，NC的部分)獲得 新鮮的人肝臟細胞懸浮液。每種Cel IzDirect方法處理懸浮液，然后在化PtoMAIN培養液中 (目錄號1103-250;Giga切te，化anford，CT)再懸浮，W1.88 X 1〇5細胞/cm2鋪板在用肝臟生 物基質支架包被的多孔培養板中或I型膠原上（化g/ml、Meridian目錄號A33704H)。
[0134] 膠原化學分析:生物基質支架中的膠原量基于徑脯氨酸化yp)含量來評估。粉碎、 清洗并凍干整個肝臟的樣本W及生物基質支架的樣本。然后水解等分試樣并進行氨基酸分 析SI, W及基于300殘基/膠原的hyp值來評估每種總蛋白中的膠原量。
[0135] DNA和RNA含量的定量分析:為了評估保留在脫細胞化肝臟生物基質中的總DNA，稱 重新鮮大鼠肝臟組織和脫細胞化的生物基質，切割并用蛋白酶K消化，W及分離總的細胞 DNA52。為了評估保留在脫細胞化的肝臟生物基質中的總RNA，稱重新鮮大鼠肝臟組織和脫細 胞化的大鼠肝臟生物基質，然后在TRIzol溶液（Invitrogen)中均質化，W及分離總的細胞 RNA。
[0136] 生長因子測定:將大鼠肝臟、大鼠肝臟生物基質支架、人膽管組織和人膽管生物基 質支架的樣本(每種兩個樣本)送到RayBiotech, Inc(Norcross ,Georgia)用于生長因子的 分析。將運些樣本均質化，制備為裂解物，并且然后用Img/ml蛋白進行測定，產生巧光，所述 巧光W巧光強度單位(FIU)定義。使用RayBio*''Human Growth Factor Arrays,G Series 1 進行半定量生長因子測定。FIU減去來自關于非特異性結合的陰性對照的FIU，并標準化為 蛋白濃度。將來自一式兩份的數據取平均值。使用四組陣列來實現針對~40種生長因子的 測量。雖然該測定開發用于人生長因子，但是其在與大鼠生長因子的交叉反應中具有足夠 重疊 W使得可W用于大鼠和人樣本。
[0137] 透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡檢查(TEM和SEM):對于TEM，W憐酸鹽緩沖鹽水 (PBS)沖洗生物基質支架，并在抑7.4的3 %戊二醒/0.1二甲腫酸鋼中固定過夜。在W二甲腫 酸鋼緩沖液沖洗S次后，生物基質支架在1%四氧化餓/0.1二甲腫酸鋼中后固定1小時。在 去離子水中沖洗后，將其脫水并嵌入化lybed812環氧樹脂(Polysciences,Niles, IL)中。使 用金剛石刀垂直于基底W70nm切片生物基質支架。超薄切片收集在200網孔銅網上，并用 4%水性醋酸雙氧軸染色15分鐘，然后用Reynolds'巧樣酸鉛染色7分鐘。使用WSOkV操作的 LEO EM910透射電子顯微鏡（LEO Electron Microscopy,Oberkochen,Germany)觀察樣本。 使用Gatan Orius SClOOO CCD數碼相機和Digital Micrograph 3.11.0(Gatan， Pleasanton ,CA)采集數字圖像。
[0138] 對于沈M，在固定和沖洗后，將生物基質支架脫水并在100%乙醇中轉移至Balzers CPD-020臨界點干燥機(Bal-Tec AG，Balzers，Switzerland)，使用二氧化碳作為過渡溶劑 干燥。該基質利用碳膠標簽安裝在侶質試樣支持物上，并使用化mmer X噴涂機(Anatech， Worcester MA)用IOnm厚的金鈕合金(60:40合金)包被。在5kV加速電壓時使用Zeiss Supra 55 FE沈M檢查樣本并使用Zeiss SmadSEM軟件（Carl Zeiss SMT,Germany和Iliornwood， NY)采集數字圖像。
[0139] 免疫細胞化學和免疫組織學:對于生物基質支架上培養的細胞的巧光染色，細胞 在室溫下W4%多聚甲醒(PFA)固定20分鐘，W皿SS沖洗，在皿SS中W10%山羊血清封閉2小 時，并沖洗。固定細胞在4°C下用第一抗體解育過夜，清洗，用標記的同種型特異性第二抗體 解育1小時，清洗，用4'，6-二脈-2-苯基嗎I噪(DAPI)復染W用于細胞核的可視化，并使用 Leica DMIRB倒置顯微鏡化eica，Houston，TX)觀察。
[0140] 對于免疫組織化學，生物基質支架在4%PFA中固定過夜并在70 %乙醇中保存。它 們嵌入石蠟中并切割為~扣m切片。對切片脫蠟，W及修復抗原。內源性過氧化物酶通過在 0.3%此化溶液中解育30分鐘而封閉。在W10%馬血清封閉后，在4°C施加第一抗體過夜;使 用RTU Vectastain試劑盒（Vector Laboratories,BurIingame,CA)進行第二抗體和ABC染 色。Vector Nova R抓用作底物。將切片脫水，固定并嵌入Eukitt封固培養液中化Iectron Microscopy Sciences，化tfield ,PA)，并使用倒置顯微鏡分析。用于肝臟切片和用于培養 的抗體列于表4中。
[0141] 逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)分析:WlpSC在細胞培養板上培養，并且該集落轉 移到生物基質支架上。在進一步培養7天后，該集落裂解用于RT-PCR。使用RNeasy Plus Mini試劑盒（Qiagen GmbH,Valencia CA)根據廠商說明書提取總RNA。使用Swerscript First-Shand SynthesiS系統進行逆轉錄用于RT-PCRQnvitrogen，(^irlsbad,CA)。使用 HotSl:a;rTaq Master Mix試劑盒（Qiagen)用于PCR JCR引物列于表5中。
[0142] 活體/死亡試驗和細胞存活試驗：活體/死亡存活力測定試劑盒（Molecular Probes/Invihogen，Carlsbad ,CA)用于粘附和增殖測定。hHpSC或肝細胞與兩種探針巧黃 綠素-AM(活體，淺灰色）和漠乙非晚同型二聚體-UEt加-1，死亡)解育，分別用于細胞內醋 酶活性和質膜完整性。在巧光Olympus SZX12立體顯微鏡（OLYMPUSJapan和Melville,NY) 下觀察樣本。遵循廠商手冊使用刃天青細胞存活力測定試劑盒(Biotium，化ywarcUCA)。簡 要的說，10 %刃天青溶液添加至培養的培養液中并在37 °C下解育過夜。使用Biotek Syne巧y HT多檢測酶標儀(Winooski，VT)獲得OD日7日-〇〇6日日吸光度，并繪制存活力曲線。所有 實驗在每個實驗條件下使用最少3份樣本進行=次。
[0143] 肝特異性功能測定：使用P450-G1O?篩選系統。'〇111日旨日，1日山3〇11，￥1)檢測〔￥口450 3A4活性。簡要的說，在37°C下，培養的細胞與含有發光的CYP3A4底物(對于CYP為巧光素 PPXE)的培養液解育4小時。使用Wallace Victors Multilabel Counter(現在是Waltham， MA的Perkins/Elmer的部分)根據廠商說明書進行巧光素檢測和分析。使用人白蛋白化ISA 定量試劑盒(Be thy 1 Laborator i e S，MontgomeiT，TX)進行定量白蛋白分泌。針對尿素合成 分析，細胞與2mM錠解育24小時，收集上清液并使用如antichrom尿素測定試劑盒(Bioassay Sy stems，化yward，CA)測定。對來自針對每個培養條件的一個樣本的上清液一式S份進行 測定，并且該實驗重復3次。
[0144] 統計分析:針對每個條件使用一式兩份或一式S份樣本重復實驗至少2-3次。呈現 了來自代表性實驗的數據，而在多次實驗中觀察到類似的趨勢。所有誤差條代表了 S.E.M。
[0145] 使用新的四步方案制備生物基質支架:使用包括脫脂而后高鹽提取的方案并使用 灌注方法（圖1)制備生物基質支架。該方法中給出了方案的詳細介紹。運通過新的四步方案 來實現：1)溫和脫脂；2)用具有約2. OM至約5. OM(例如2.0M-2.5M、2.6M-3. OM; 3.1M-3.5M、 3.6M-4.0M、4.1M-4.5M; 4.6M-5. OM)鹽濃度的緩沖液清洗，所述鹽濃度已知維持膠原處于不 溶狀態23(緩沖液的精確濃度和抑由組織中的膠原類型確定），所述濃度已知維持膠原處于 不溶狀態 23;3)核酸酶處理W消除殘留的核酸；W及4)用基礎培養液沖洗W消除去污劑、鹽 和核酸酶殘留物，W及用培養液平衡基質成分(圖1A)。
[0146] 針對核酸酶的沖洗培養液或緩沖液的選擇可W是多種選擇中的任一種，只要鹽濃 度和離子強度得W維持基質成分處于不溶狀態。脫脂方法的選擇對于有效且溫和是關鍵 的。我們選擇脫氧膽酸鋼(SDC)和憐醋酶A2(PLA2)的組合來將位于質膜和線粒體膜上的憐 酸甘油醋快速降解為溶血卵憐脂，其是一種強力表面活性劑，其可W誘導壞死和細胞裂解。 圖8顯示了反應式。我們避免強力去污劑，諸如十二烷基硫酸鋼(SDS)或化iton-X 100,其可 W裂解一些基質成分，諸如葡萄糖胺聚糖（參見Gi化ert等人的綜述"Dece Ilularizat ion of tissues and organs",Biomaterials 27:3675-3683(2006))。
[0147] 我們避免支架在脫脂和高鹽清洗期間長期暴露在來自破裂細胞的酶，因為它們可 W極大的降低彈性蛋白的含量和葡萄糖胺聚糖(GAG)的含量，所述葡萄糖胺聚糖諸如硫酸 肝素化S)、硫酸軟骨素(CS)、硫酸皮膚素(DS)和肝素化P)，它們是細胞因子和生長因子結合 的部位 24。我們使用大豆膜蛋白酶抑制劑并小屯、控制抑(7.5-8.0)、溫度(20°C)、和時間（30-60分鐘）W限制源自破裂細胞的蛋白酶的活性。
[0148] 我們通過相關脈管（例如，肝臟中的口靜脈)灌注整個組織，運使得我們快速分離 (幾個小時內）生物基質支架而使基質成分的損失最小化。分離的快速是由于用去污劑的初 始步驟在大約30-60分鐘（而不是像其他使用的方案中的數小時或數天）內使組織脫脂。產 生的生物基質支架是透明或白色的（圖1)。此外，使用該灌注方法，我們維持了初始的脈管 通道、n靜脈和肝靜脈W及肝臟中的大部分血管分支，運增加了脫細胞化效率。通過生物基 質支架灌注的巧光羅丹明標記的葡聚糖顆粒保持在脈管殘留物內，運表明它們是顯著的 (圖化）。存在染料從大血管沿通道逐漸流入組血管分支而沒有泄露。該事實在支架的血管 再形成中將是有幫助的，所述血管再形成作為制備工程改造的組織用于=維培養和/或用 于體外植入的方法。
[0149] 在切片時，支架保持了初始組織的組織學結構，包括主要組織學實體中的可識別 殘留物，諸如血管、膽管、W及格利森氏囊(GC)(圖1)。對比圖IBl和IDl，其中肝臟組織的切 片與生物基質支架的切片對比。實質細胞壁的基質殘留物由網格狀網絡組成(圖1D2-1D3)。
[0150] 膠原、膠原結合蛋白和結合細胞因子保持在生物基質支架中：生物基質支架中的 膠原量通過前面所使用的方法通過氨基酸分析來評估 25。因為徑脯氨酸化yp)對于膠原和膠 原蛋白是獨特的，相對于總蛋白的膠原組成表示為每1000個氨基酸中的Hyp殘留。該結果表 明膠原含量從幾乎不可檢測的水平，即肝臟中小于0.2殘留的徑脯氨酸化ypVlOOO,增加至 生物基質支架中~13殘留的Hyp/1000。運表明如上所述的脫脂和高鹽清洗沒有去除膠原， 在生物基質支架中留下幾乎所有的膠原。檢測到生物基質支架中顯著水平的另一種膠原相 關氨基酸-徑賴氨酸化yl)，W及更高水平的甘氨酸(Gly)支持了我們的結論，即膠原在生物 基質支架中是明顯富集的（圖2A、9和表2)。
[0151] 使用免疫組織化學和超微結構研究，我們能夠在支架中鑒定肝臟中原位發現的所 有已知形式的膠原，包括纖維狀膠原和V型膠原，對于小纖維為10-30nm直徑，對于裝 配纖維為500-3000nm直徑）和珠狀纖維(可能是VI型）。那些纖維和纖絲存在于間皮層下的 包膜下結締組織層中。盡管在沿口 =聯管至中央靜脈的血竇中沒有發現基膜的典型結構， 我們發現了 IV型膠原和一些結合小纖維形成網狀、多孔3D網格結構，其充當用于實質細胞 的支架（圖2)。1型膠原束可視為支架的主要結構，其他型膠原、糖蛋白、W及蛋白聚糖附著 至所述支架的主要結構。在狄氏間隙中，我們發現I型膠原的小束和HI型和IV型W及一些V 型膠原的纖維，所述V型膠原纖維在口=聯管和中央靜脈附近更豐富。代表性的免疫組織化 學數據呈現于圖3B中，W及基質成分和它們在正常肝臟組織中的位置與它們在生物基質支 架中的位置的比較的概要列于圖4D中。在針對生物基質支架制備的方案發展中的早期研究 表明，大量的細胞骨架成分在清洗中丟失。但是，我們通過免疫組織化學評估支架，并且我 們沒有發現微管蛋白、肌間線蛋白或肌動蛋白、微量的細胞角蛋白18和19、W及低水平的波 形蛋白遍布整個支架的證據。
[0152] 與膽管W及部分肝血管系統（動脈和靜脈血管)相關的基質由典型的基膜結構組 成，所W與在血竇中發現的脈管結構相關的基質薄層相當不同。層粘連蛋白、巢蛋白/內功 素、基底膜聚糖和IV型膠原發現于口=聯管中，而在狄氏間隙中僅發現基底膜聚糖和一些 IV型膠原。存在大量的疏水、波狀彈性蛋白；它交聯在一起并形成片層和纖維，其主要限定 于包膜下結締組織、n靜脈區、W及動脈壁。纖連蛋白普遍存在并遍及于肝基質中，并且在 狄氏間隙中是尤其豐富的，在那里它們形成細纖絲或粒狀沉積（圖2和3)。
[0153] 免疫組織化學表明，組織中已知的蛋白聚糖保存于生物基質支架中（圖3B、4D)。在 鑒定的異質蛋白多糖中，沿血竇間插且并連續地發現多配體聚糖，而基底膜聚糖在狄氏間 隙中更間插。發現HS-PG和CS-PG的形式遍及生物基質支架中的血竇的殘留物，其模式與肝 臟組織中已知成帶相關。
[0154] 蛋白聚糖和其他基質成分對于細胞因子和生長因子是重要儲庫，所述細胞因子和 生長因子緊密結合至它們的GAG26。大部分生長因子和激素發現于生物基質支架中，其接近 初始組織中發現的濃度。在表6中，給出了來自大鼠肝臟裂解物和大鼠肝臟生物基質支架的 比較的數據，W及在表3中，提供了來自人膽管組織與膽管生物基質支架的比較的平行數 據。有趣的是，存在肝臟生物基質支架中相比于肝臟裂解物所發現的強烈富集的幾個實例 (例如，bFGF)。結合的生長因子和細胞因子在肝臟與膽管組織的支架的比較之間在定性和 定量上是不同的，其暗示了組織特異性或物種特異性。可替代的，它可W，部分地，是由于膽 管支架需要通過在搖桿上搖動緩沖液中的組織而不是通過穿過脈管灌注來制備的事實。
[0155] 生物基質支架的化學物與組織學相關：該新方案的重要特征在于保留基質化學 物，其模式與口 =聯管至中央靜脈的肝腺泡區1-3并與組織學實體諸如血管通路和格利森 氏囊(GC)相關，如圖4A-C中所示。區1中的口靜脈周圍的基質化學物類似于胎兒肝臟中所發 現的基質化學物，并且部分地由HI型膠原、層粘連蛋白、W及CS-PG的形式組成。它轉變為 中部腺泡(區2)和中屯、周圍區（區3)中不同的基質化學物，其終止于非常穩定的具有高水平 IV型膠原和HP-PG的基質27。
[0156] 已知的是，多種蛋白（例如，生長因子和激素、凝固蛋白、各種酶)通過結合至GAG中 離散且特定的硫酸化模式或結合至其他基質成分而結合至基質并保持穩定 24。因此，基質化 學物從干細胞食中的其起始點（具有與高轉化和最小限度硫酸化相關的不穩定基質化學 物)轉換為穩定的基質化學物并具有增加量的硫酸化，并向中屯、周圍區進行。我們期望天然 結構W及與組織學結構相關的基質化學物的保持將通過將細胞引導至生物基質支架上的 特定部位和/或提供合適的信號混合物來驅動擴張和/或分化為成熟細胞來促進組織工程 改造過程中的再細胞化。
[0157] 生物基質支架可W由不同組織和物種來制備:生物基質支架可W由任何正常或病 態的組織和由任何物種來容易地制備。在圖13-16中，我們顯示了來自人膜腺、膽系、和十二 指腸 W及來自大鼠和豬膜腺的生物基質支架。在圖5-7和圖12中顯示了牛或大鼠肝臟生物 基質支架對肝細胞的影響。另外，生物基質支架由人腹主動脈、骼靜脈、W及由大鼠和豬的 腸來制備。對生物基質支架的組織學、超微結構和免疫組織化學研究表明了在它們的結構、 化學組成、W及功能中具有明顯的組織特異性，而沒有物種特異性。
[0158] 生物基質支架誘導和/或維持細胞的分化:將WlpSC鋪板在具有肝臟生物基質支架 切片的皿上W及對于成體肝臟細胞定制的HDM中，導致基本100%的活細胞在幾個小時內附 著在生物基質支架上；而不論是完整的還是低溫粉碎后。在支架切片上初始形成的細胞集 落保留了它們的一些干細胞表型，因為集落中屯、的細胞能夠抵抗染料的染色（圖11)并表達 典型的肝祖細胞標記，諸如趨化因子（C-X-C基序）受體4(CXCR4)和上皮細胞粘附分子 化pCAM)(圖5)。它們分裂1次或兩次，并然后轉換到細胞周期停滯并轉換到S維(3D)索狀形 態，其對于成熟實質細胞培養物是典型的（圖5和6針對干細胞分化;與圖7和圖12對比）。所 使用的HDM不需要所有的常用細胞因子或生長因子，因為運些W結合至生物基質支架的形 式存在。轉換到生長停滯與活性染料對整個集落的染色相關（圖12)，其伴隨EpCAM和CXCR4 表達的丟失，W及成體特異性肝細胞和膽管上皮細胞基因諸如尿素和細胞色素 P450 3A4的 表達的穩定增加(圖5)。
[0159] 正常成體大鼠和成體肝細胞鋪板在I型膠原上或鋪板在來自大鼠或牛肝臟的生物 基質支架上，并且對于成體細胞鋪板于皿M中。成體實質細胞能夠在10分鐘內（即使在無血 清培養液中）附著至支架，與之相比，在數小時內附著在I型膠原上，其從附著點開始保持在 生長停滯;并在支架上保持存活和完全功能持續超過8周，與之相比，在I型膠原上保持約~ 2周（圖7和12)。在生物基質支架上成熟肝臟細胞持續數周的功能水平證實與在其他新鮮分 離的成體肝細胞的發現相同或類似 28。引入注目的區別是I型膠原上的培養物在2周后迅速 惡化，而在生物基質支架上的培養物在形態和功能上保持穩定，持續維持培養物的時間（到 目前為止~8周）。
[0160] 生物基質支架包含了大部分組織的細胞外基質成分和基質結合細胞因子及生長 因子，其提供一組復合的化學信號，其可W用于不溶的、穩定的支架，其具有特別的能力W 誘導WlpSC為成體肝臟命運，W及維持成體細胞完全分化持續數周。對比研究人員制備的基 質提取物的現有類型與本發明的生物基質支架的類型，明顯的是，物理處理、酶處理和化學 處理對組成、機械行為、W及對源自天然組織和器官脫細胞化的生物支架的宿主反應有實 質性的影響，并且相應地，對于它們的體外和體內應用具有重要啟示。所有其他現有的用于 制備基質或支架的方法通過使用基質降解酶IS或使用溶解大部分基質的緩沖液11而導致大 部分基質成分的去除。物理方法(例如，速凍和攬拌)可W作用W從具有分層結構的組織諸 如真皮(例如，SIS、BSM) 29制備基質提取物，，但不能用于具有復雜組織結構的器官，諸如肝 臟。通過對比，我們用于生物基質支架的方法導致大部分細胞蛋白的損失，但保存了基本全 部或至少大部分膠原和膠原結合成分，包括基質結合細胞因子、激素和生長因子。
[0161] 細胞外基質嵌入嵌合體脂質雙分子層中，甚至在最簡單生物體中，其是復雜的、異 質且動態的環境。脫脂方法是方案的關鍵方面。對于組織脫細胞化通常使用的方法包括離 子型去污劑，諸如SDC和十二烷基硫酸鋼(SDS)dSDC比SDC相對更溫和，傾向于引起對天然組 織結構的更少的破壞，并且在溶解細胞質膜和核細胞膜上效率更低W。沒有單獨使用SDC進 行組織脫細胞化的報告。許多研究使用強力非離子型去污劑(例如，Triton X-100)3i或兩性 離子去污劑(例如，3-[(3-膽酷胺丙基)二甲基胺基）]-1-丙橫酸鹽，CHAPS) 32。通過對比，我 們使用SDC和PLA2組合的方法對組織快速且溫和地脫脂。
[0162] 目前為止已經在脊椎動物中鑒定了至少29種類型膠原（I-XXIX)，所述膠原在細胞 粘附、分化、生長、組織發育和結構完整性中具有功能作用33'34。基質中的主要結構成分，膠 原，