用于工業規模分散的生物基質支架的制作方法
【專利說明】
[0001 ] 本申請是申請日為2011年7月1日、申請號為201180042690.1、發明名稱為"用于工 業規模分散的生物基質支架"的PCT申請的分案申請。
[醒]優先權聲明
[0003] 本申請在35 U.S.C.§119(e)下要求2010年7月2日提交的、序列號為61/360,939的 美國臨時申請的優先權，其全部內容通過引用并入本文。
[0004] 政府支持聲明
[0005] 本發明的各方面在國立衛生研究院(NIH)資助號AA014243和IP30-DK065933、國立 糖尿病、消化系統和腎病研究院（NIDDK)資助號DKW987、國立癌癥研究院（NCI)資助號 CA016086和國立牙科和煩面研究所資助號DE019569的政府支持下做出。美國政府對本發明 具有一定的權利。
技術領域
[0006] 本發明設及生物基質支架和產生生物基質支架的方法，W及它們作為完整支架或 作為W各種方式被切片或粉碎W及被分散W用于特定的實驗和臨床用途的支架在不同應 用中的用途。
【背景技術】
[0007] 先體內后體外(ex vivo)或臨床項目如細胞療法中使用分化細胞的能力取決于維 持具有成體表型并具有完全功能的細胞或能夠譜系限制干細胞或祖細胞（"干/祖細胞"）W 實現該成體表型的能力。干細胞研究中正在進行的革命已經使得干/祖細胞群體包括來自 胚胎、胎兒和出生后組織的那些的鑒定和分離成為可能1。針對所有成體細胞類型鑒定和分 離干/祖細胞的能力W及使它們擴增和分化的能力極大地增加了利用它們用于制藥學及其 他工業研究項目、用于學術研究W及用于臨床項目諸如基于細胞的療法和組織工程的潛 能2。
[000引目前用于先體內后體外維持分化細胞或將干細胞譜系限制為成體命運的方法是 部分成功的，并且設及將細胞鋪板在或嵌入一種或多種細胞外基質成分的基質并嵌入對于 所需成體表型定制的由特定激素、生長因子、和營養物組成的培養液中。對于非常原始的干 細胞諸如胚胎干化S)細胞或誘導多能干細胞（iPS)，或出生后衍生的可W轉變為多種成體 命運的干細胞，諸如間充質干細胞(MSC)或羊水來源干細胞(AFSC)，運些干細胞經受可溶性 信號和/或細胞外基質成分的混合物，并必須經數周時間W多組運樣的信號進行處理。典型 地，所實現的成體表型隨著每次制備是不同的，并具有某些成體特異基因的過表達或低表 達和/或一種或多種成體組織特異性基因的異常調節。
[0009]細胞外基質由細胞分泌，在一個或多個細胞表面上與它們鄰近，并且已經長期被 理解為是對于細胞的結構支持物7。它是由多種生物活性分子組成的極其復雜的支架，所述 生物活性分子被高度調節，并且對于決定附著細胞的形態、生長和分化是關鍵的 8。培養細 胞的組織特異性基因表達通過在基質提取物或純化的基質成分上培養細胞來改善9。然而， 個別基質成分，單獨的或組合的，不能夠概括組織的復雜基質化學和結構。運與下列事實相 關:基質成分處于與自然組織區域W及與組織學結構諸如血管相關的梯度中。組織基質的 運種復雜性更加容易通過對組織脫細胞化并留下基質作為殘留物的提取法來實現w'll。然 而，當前的脫細胞化方案由于使用溶解基質成分的基質降解酶或緩沖液而導致一些基質成 分的大量流失。
[0010] 本發明提供了生物基質支架W及制備和使用運樣的生物基質支架的方法。本發明 的方法導致產生富含組織的大部分膠原并具有結合基質成分和基質結合激素、生長因子和 細胞因子的組織特異性提取物，所述膠原、結合基質成分和基質結合激素、生長因子和細胞 因子對成熟細胞和干/祖細胞群體的譜系限制共同地產生重復性更高且更有效的分化效 果。
【發明內容】
[0011] 本發明提供了由生物組織產生生物基質支架的方法，所述生物基質支架用于分散 (例如，利用所述量，例如實施例2中所述的方案中所述的量的工業規模分散)至培養裝置上 的方法，其包括:a) W包含約3.5M化Cl至約4.5M化Cl的鹽濃度的緩沖液灌注生物組織或 使生物組織均質化;b)在第一培養液中W包含脂肪酶和/或去污劑的脫脂緩沖液灌注步驟 (a) 的生物組織或提取步驟(a)的勻漿，其中所述第一培養液的重量摩爾滲透壓濃度是約 250m0sm/kg至約350m0sm/kg，W及所述第一培養液是無血清的且處于中性pH;然后
[0012] C)用處于中性pH且包含約2.OM化Cl至約5.OM化Cl的鹽濃度的緩沖液灌注步驟 (b) 的組織或提取步驟(b)的勻漿，選擇所述濃度W保持生物組織中鑒定的膠原不溶;然后
[0013] d)在緩沖液中用核糖核酸酶(RNase)和脫氧核糖核酸酶(面ase)灌注步驟(C)的組 織或提取步驟(C)的勻漿；W及然后
[0014] e)用處于中性pH、無血清、且具有約250m0sm/kg至約350m0sm/kg的重量摩爾滲透 壓濃度的第二培養液沖洗步驟(d)的組織或步驟(d)的勻漿，進而從所述生物組織產生完整 的或均質化的生物基質支架，所述生物基質支架包含生物組織的至少95%的膠原和大部分 膠原結合基質成分W及基質結合生長因子、激素和細胞因子；
[0015] f)在基礎培養液中稀釋所述生物基質支架；
[0016] g)在約-80°c冷凍(f)的生物基質支架；
[0017] h)通過低溫研磨將(g)的生物基質支架粉碎為約1皿至約100皿大小范圍的生物基 質顆粒；
[0018] i)在基礎培養液中懸浮解凍化)的生物基質顆粒；W及
[0019] j)將步驟（i)的生物基質顆粒分散至培養裝置上，進而從生物組織產生生物基質 支架，所述生物基質支架用于分散(例如，如本文所述的工業規模分散)至培養裝置上。
[0020] 本發明還提供了通過本發明方法產生的生物基質支架。
[0021] 本發明的前述和其他方面現在將關于本文描述的其他實施方案來進行更加詳細 描述。應該理解的是，本發明可W W不同形式體現，并且不應該解釋為限于本文所述的實施 方案。還有，提供運些實施方案，使得本公開將徹底且完整，并且將本發明的范圍充分地傳 達給本領域技術人員。
[00剖附圖簡要說明
[0023] 圖IA-El:大鼠肝臟生物基質支架制備。(A)四步脫細胞化過程，包括灌注清洗、W PLA2和SDC脫脂、高鹽量清洗、W及核酸酶處理用于核酸去除。（B-D)在大鼠生物基質支架制 備中的四個階段。（B)在用基礎培養液灌注清洗10分鐘后，肝臟變得蒼白；（C)在脫脂期間， 肝臟在GC下變得部分透明；（D)最終的完整支架在40分鐘灌注后看起來透明；化）W低放大 倍數顯示的生物基質支架。化1)用若丹明標記的葡聚糖顆粒灌注的支架可視化表明了沿通 道從大血管至細血管分支的漸增流量，且沒有泄露，表明支架中的專有脈管。在不同階段的 生物基質支架的相應蘇木精和伊紅化&E)染色表明，封裝實質細胞的組織學結構如血管和 網格狀基質被保留，而細胞被去除。正常的大鼠肝口=聯管結構由口靜脈（PV)、肝動脈 (HA)、和膽管(BD)組成(BI);在脫細胞化過程期間，基質纖維隨著細胞被逐漸去除而變得透 明（Cl);對比（BI)和(Dl)，脫細胞化肝口 S聯管區；D2和D3顯示所有細胞從基質支架去除， 但網狀結構被保留，諸如血管、GC、及圍繞實質細胞壁的網格狀基質。
[0024] 圖2A-H:大鼠肝臟生物基質支架的TEM(A-C)和SEM(D-H)圖像。（A)具有厚壁(W)的 血管(BV)的低放大倍數。I型膠原(大箭頭)是眾多的并且包含不攝取重金屬染料的纖維的 橫截面（白點、小箭頭）。（B)血管壁的更高放大倍數顯示了基膜(大箭頭）、無定形彈性蛋白 (*)和相關彈性纖維、少量的膜囊泡殘留物(小箭頭）、1型膠原帶狀纖維(箭頭)和小纖維(小 箭頭）。小纖維可能是原纖蛋白（VI型膠原），其與I型膠原密切關聯且幫助組織I型膠原。（C) 具有64nm帶型模式的I型膠原的高放大倍數(箭頭）。（D)具有薄壁(BV)的血管和更大血管 (W)的壁的低放大倍數。化)在更高放大倍數，大血管壁(W)是圓齒狀的，與口 =聯管的肝動 脈一致，參見(A)。在壁下是眾多的I型膠原束(大箭頭），其由長分支型薄的、網狀的（III型） 膠原纖維(小箭頭)連接。（F)大束的I型膠原具有特征性的平行纖維(大箭頭），其與各種較 小纖維(箭頭)和結節或珠狀纖維(箭頭)關聯。（G)在平面中互連的大/小纖維的3D網絡，其 將邊界形成例如為肝血竇。化)網絡的更高放大倍數顯示了各種纖維(箭頭）：ni型膠原(更 大直徑直線）、彈性纖維或VI型膠原。
[0025] 圖3A-B:生物基質支架中膠原的化學分析和細胞外基質化CM)成分的表達。（A)所 有在膠原中發現的S種氨基酸的含量:徑脯氨酸化yp)、徑賴氨酸化yl)及甘氨酸(Gly)。數 字表示每種氨基酸/1000氨基酸的殘留。該數據顯示脫細胞化過程中膠原含量顯著增加，其 從肝臟中<0.2%至生物基質支架中的大于15%。(8)生物基質支架中基質分子的免疫組織 化學染色，顯示了肝臟生物基質支架中層粘連蛋白（LAM)、硫酸肝素化S)、III型膠原(0)L3) 和纖連蛋白（FN) W及與血管壁殘留物相關的典型的基膜蛋白的分布。在更高放大倍數，本 領域技術人員可W觀察基膜的主要成員，包括IV型膠原（CX)L4)、巢蛋白化nt，也稱為內功 素）、層粘連蛋白（LAM)和基底膜聚糖(Per),其是靠近口 S聯管的支架部分中服-PG的形式。
[0026] 圖4A-D:生物基質支架中從口 S聯管至中央靜脈的ECM成分的模式。正常肝臟(A) 與肝臟生物基質支架(B)的從口 =聯管（1區）至中央靜脈(3區）的組織學比較;兩者都是蘇 木精/伊紅染色切片。（C)該模型示意肝臟中干細胞和成熟譜系系統，其具有顯示形成與肝 分區相關的模式的代表性基質成分。成分W免疫組織化學的發現中的豐度的順序列出。人 肝臟中已知的譜系階段在1區口靜脈周圍（n=聯管周圍)開始并且進行成熟，在3區中W調 亡細胞結束。在肝臟干細胞食中鑒定的已知基質化學物包括透明質酸、III型膠原、與Q6M 整聯蛋白結合的形式的層粘連蛋白、W及弱硫酸化形式的CS-PG 43'44。只是在干細胞食外側 發現IV型膠原、通常硫酸化的CS-PG和HS-PG、W及與郵1整聯蛋白結合形式的層粘連蛋白。 HP-PG已經證實獨特地位于中屯、周圍45、46。（0)肝臟中基質成分和它們的位置與生物基質支 架中基質成分及其位置的比較的研究，從免疫組織化學發現中總結的數據(N/D =未測試。* 由其他人員發現的僅僅靠近中央靜脈）。細胞骨架的多數成分在清洗期間丟失，存在細胞骨 架蛋白的一些殘留物但非全部。支架缺乏可檢測量的微管蛋白、肌間線蛋白和肌動蛋白（鬼 筆環膚測定）。然而，存在在支架中隨機分散著的痕量細胞角蛋白；在口=聯管的血管殘留 物周圍痕量的a平滑肌肌動蛋白；W及遍布的低水平的波形蛋白。
[0027]圖祀-I:肝臟生物基質支架上與I型膠原上比較的MpSC的表征。相差圖像(A-D)顯 示了源自相同肝臟并在無血清Kubota^培養液中和在組織培養塑料(A)上和在I型膠原上 (B) 上培養的WlpSC集落的形態變化，所述組織培養塑料是一種用于自我復制的條件，其與 對于肝臟的無血清分化培養液中的分化條件對比，所述I型膠原與在牛肝臟生物基質支架 上(C-E)對比。有功能的和完全存活的培養物在I型膠原上存活不超過~2周。通過對比，在 肝臟生物基質支架上的細胞是存活且健康的，且具有功能的所有組成成分，且持續至少一 個月。培養物通過7-12天轉換為具有增加的細胞質/細胞核比率和標記的糖原表達的細胞 (C) ，并且然后轉換為具有通過清楚膽小管散布的典型多邊形細胞形態的細胞(D)，所述培 養形態在其后持續，如第24天的代表性培養物所顯示的化KRT-PCR測定顯示了第7天在培 養塑料上(F)與在大鼠肝臟生物基質支架上(G)相比較、在自我復制條件下WlpSC的基因表 達變化。我們對比W下表達，MpSC標記，包括CXCR4和EpCAM;早期肝細胞基因，包括CK19 化RT19)、HNF6、F0XA2、AFP和低水平的白蛋白；成熟肝細胞標記，包括高水平的白蛋白 (ALB)、轉鐵蛋白（TFKCYP450-3A4、酪氨酸轉氨酶(TAT)、和葡萄糖-6-憐酸酶(G6PC)，W及 膽管上皮細胞基因，包括CFTR、伽馬谷氨酷轉膚酶(GGT1)、陽離子交換2(AE2)和頂端鋼依賴 性膽汁酸轉運蛋白（ASBT)。生化測定測量I型膠原上與大鼠肝臟生物基質支架上的培養物 中合成的尿素化），W及測量I型膠原上與由大鼠或牛肝臟制備的生物基質支架上的培養物 中CYP450-3A4活性（I)。表7提供了定量測量的總結，其比較了在針對自我復制的培養條件 下（III型膠原）、或在針對I型膠原與肝臟生物基質支架上相比的分化的條件下新鮮分離的 WlpSC的附著、存活力、生長、培養生命周期、W及組織特異性基因表達。
[002引圖6A-D:在生物基質支架上由WlpSC譜系限制的細胞的免疫巧光染色。（A) W肝特 異性標記白蛋白（A化，淺灰色）染色和W肝干細胞表面標記EpCAM(白色)染色。注意的是鋪 板在生物基質支架上的細胞不表達EpCAM。比例尺= 200wii"(B)W早期肝標記甲胎蛋白 (AFP，淺灰色）和針對人膽管上皮細胞標記細胞角蛋白19(CK19,白色）的抗體染色，所述標 記在該表達水平顯示成熟膽管上皮細胞。針對CK19的抗體測定是人特異性的，并且不染色 沒有細胞接種的支架中大鼠 CK19處的殘留物。AFP表達是低的但在第7天仍是明顯的。比例 尺=200皿。（C) WA化(淺灰色)和肝星形細胞標記、a-平滑肌肌動蛋白（ASMA，白色)染色。白 蛋白和ASMA的表達強烈顯示正在成熟的肝細胞和星形細胞都存在。比例尺=IOOWIId(D) W 功能肝蛋白CYP450-3A4(淺灰色)和膽管上皮細胞特異性標記分泌素受體(SR,白色)染色， 所述標記顯示正在成熟的肝細胞和膽管上皮細胞是功能性的并且表達針對運兩種細胞類 型的典型標記。比例尺=200皿。
[0029]圖7A-D:生物基質支架上的完全功脂性的、成熟人肝細胞的穩定性。成體肝細胞鋪 板在分化培養液中，W及鋪板在I型膠原(A、B)上與牛肝臟生物基質支架(C)上對比，它們是 低溫粉碎的、分散在培養液中并允許沉積在板上。I型膠原上的細胞是完全存活的并且在第 7-12天(A顯示第7天)處于它們的分化峰值;它們在~2周后開始惡化，并通過20天(B)它們 死亡、正在死亡和無功能。通過對比，鋪板在肝臟生物基質支架上的那些細胞(C)持續至少8 周是有功能的(還沒有評估更長時間）；運里顯示的21天后在粉碎的肝臟生物基質支架上的 培養物中。對于鋪板在生物基質支架上與I型膠原上相比的冷凍成體肝臟細胞的兩種獨立 制備物的培養的CYP450-3A4測定，并且在第12天測定(D)。樣本ZHep-007代表在解凍后具有 良好附著的低溫保存樣本;樣本化-013代表在解凍后具有差附著或無附著的那些批次。因 此，即使運些更差質量的樣本能夠附著至生物基質支架并長期維持存活。在所測定的兩種 樣本中，P450S水平在肝臟生物基質支架上培養時更高。隨著在生物基質支架上的時間推 移，更差質量的冷凍保存的批次將得到改進。
[0030] 圖8:通過脫氧膽酸鋼激活憐脂酶A2來產生溶血卵憐脂。該方案的原理：由脫氧膽 酸鋼激活的憐脂酶A2(PLA2)將使位于細胞質膜和線粒體膜上的憐酸甘油醋降解為溶血卵 憐脂，所述溶血卵憐脂是強力表面活性劑，其誘導細胞壞死。
[0031] 圖9:大鼠肝臟與大鼠肝臟生物基質支架相比的膠原組成分析。生物基質（黑色)和 整個肝臟(淺灰色)的氨基酸成分W玫瑰圖形式呈現。對于分析的每種氨基酸使用=字母縮 寫。沒有分析色氨酸和半脫氨酸。數字顯示氨基酸殘基/1000。
[0032] 圖10A-C:大鼠肝臟生物基質支架的核酸分析。肝臟生物基質載玻片的相差圖（A) 和巧光DAPI染色(B)，W及來自大鼠新鮮肝臟組織與生物基質支架(C)相比的總DNA及RNA的 定量測定。
[0033] 圖11A-C:在將抽pSC鋪板至生物基質支架上W后的生物基質支架的染色。活體(巧 黃綠素-AM,白色)/死亡(漠化乙錠或化D-化1，淺灰色)測定顯示WlpSC集落在生物基質支架 切片上是存活的，但在集落中部(A、B)在前幾天沒有攝取染料，運是由于干細胞中的已知累 (例如MDRl)消除了活體染料。在(B)中，巧光圖像與相位圖像合并W顯示集落中間含有細 胞。通過7天，整個集落的細胞已經分化并在幾乎整個集落的所有細胞中攝取活體染料(C)。
[0034] 圖12A-F:在I型膠原上培養的大鼠肝細胞與在大鼠肝臟生物基質支架上培養的大 鼠肝細胞的對比。第3天(A、C)和第10天(B、D)在I型膠原上和生物基質支架上培養的成體大 鼠肝細胞。它們在幾分鐘內附著在肝臟生物基質支架上并存活與測試一樣長的時間，持續 大于8周(C、D);沒有測試更長時間。培養物在生物基質支架上是非常=維的。在第1、3、5、7、 10、14、21和28天的尿素合成化)和細胞存活力測定(巧，n = 3。
[0035] 圖13A-D:人膜腺與人膜腺生物基質支架的對比。嵌入石蠟中、切片并W蘇木精和 伊紅化&E)染色的人膜腺(A)與人膜腺生物基質支架(B-D)的對比。膜島結構已經在B中描繪 出。膜腺生物基質支架的腺泡區在C和D中顯示。
[0036] 圖14:在人膜腺組織中與大鼠膜腺生物基質支架中相比發現的代表性基質成分和 一種細胞骨架成分波形蛋白。沒有發現可檢測量的其他細胞骨架成分(肌間線蛋白、微管蛋 白、肌動蛋白）或發現痕量的細胞骨架成分(細胞角蛋白）。虛線環繞膜島，注意的是多配體 聚糖1和VI型膠原在膜腺組織和生物基質支架的膜島中都是強陽性的。多配體聚糖1僅在膜 島中（虛線)發現而沒有在腺泡細胞中（箭頭)發現;III型膠原在腺泡細胞中和血管周圍（箭 頭)更富集，但在膜島中沒有。
[0037] 圖15A-C:人十二指腸生物基質支架的組織學和免疫組織化學染色。（A)人十二指 腸生物基質支架的外側和腔側。在H&E染色切片中對比正常組織(B)和生物基質支架(C)之 間的多層結構，并且結果顯示支架保留黏膜層和黏膜下層中的絨毛和血管。下圖顯示，人十 二指腸生物基質支架的免疫組織化學染色顯示保留在支架中可變數量的細胞外基質蛋白。
[0038] 圖16A-D:人膽囊組織與人膽囊生物基質支架的對比。人膽囊組織(A、B)與由其制 備的生物基質支架(C、D)的對比。組織和生物基質支架嵌入在石蠟中、切片并W蘇木精和伊 紅染色。
[0039] 圖17:Wl:24稀釋的生物基質溶液的制備實例。30ml X 3 = 90mlD30ml生物基質+ 90ml溶液5 = 120ml W1:24稀釋的生物基質溶液。
【具體實施方式】
[0040] 現將在下文中更加全面地描述本發明。然而本發明可W W不同形式體現并不應該 被解釋為限于本文所述的實施方案。還有，提供運些實施方案W使得本公開將徹底且完整， 并且將本發明的范圍充分地傳達給本領域技術人員。
[0041] 本文中本發明說明書中使用的術語僅用于描述特定實施方案的目的，并不旨在對 本發明的限定。如本發明說明書和所附權利要求書中使用的，單數形式"一個(a)"、" 一個 (an)"和"該"（the)還旨在包括復數形式，除非上下文中另有清楚的顯示。
[0042] 除非另有限定，本文使用的所有術語(包括技術術語和科學術語)具有與本發明所 屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。還將理解的是，術語諸如在通常使用的詞典 中定義的那些，應該解釋為具有與在本申請上下文和相關領域中的它們的含義相一致的含 義，且不應該解釋為理想化的或過于正式的含義，除非本文明確運樣限定。本發明說明書中 所使用的術語在本文中僅是用于描述特定實施方案的目的并且不旨在對本發明的限定。本 文中所提及的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻的全部內容通過引用并入本文。
[0043] 而且，如本文中所使用的，"和/或"是指并包括相關列出項中的一個或多個的任何 和所有可能組合，W及在解釋為可替代的（"或"）時沒有組合。
[0044] 除非上下文另有顯示，特別期望的是，本文中所描述的本發明的各種特征可W W 任何組合使用。此外，本發明還考慮在本發明的一些實施方案中，可W排除或省略本文所述 的任何特征或特征組合。為了示意，如果說明書聲明復合物包括成分A、B和C，特別期望的 是，可W單獨或W任何組合省略或放棄A、B或C中的任一個、或其組合。
[0045] 如本文中所使用的，過渡詞"基本由…組成"（W及語法變體)應該解釋為包括所述 的材料或步驟，及那些非本質上影響要求保護的發明的一個或多個基本和新的特征"的 材料或步驟。參見In re Herz,537 F.2d 549,551-52,190 U.S.P.Q.461，463(CCPA 1976) (原文中強調）；還參見MPEP§2111.03。因此，本文中所使用的術語"基本由…組成"不應該解 釋為等同于"包括"。
[0046] 如本文中所使用的術語"約"在是指可測量值如量或濃度(例如，生物基質支架中 總蛋白中膠原的百分比）等時，旨在包括所指定量的20 %、10%、5%、1%、0.5%、或甚至 0.1 %的變化。
[0047] 本發明設及生物基質支架的發現和開發，所述生物基質支架比現在已知的脫細胞 化的組織支架具有意外的改進和優勢，改進和優勢的一些實例是使用本發明的生物基質支 架有效維持成熟細胞和/或譜系限制和/或使干細胞分化為成熟命運和/或維持該成熟細胞 在長期的一段時期有功能。作為進一步實例，使用本發明的生物基質支架將產生成熟命運 的細胞的時間從約3-6周或更多降低至約1-2周。本發明的生物基質支架使用特定方案來產 生，其針對給定組織利用鹽濃度和離子強度(不同膠原具有不同溶解度常數(23))的適當平 衡，W使得保留W不溶形式存在于該組織中的天然膠原，導致生物基質支架保留了高百分 比的天然膠原，所述天然膠原提供信號W驅動譜系限制和分化。作為對比，根據已知方案產 生的脫細胞化支架沒有利用使得保留高百分比的運些天然膠原的運樣的鹽濃度和離子強 度的平衡，而大部分運些天然膠原在使用運些已知方案時丟失。此外，本發明的生物基質支 架允許產生譜系依賴(例如，分化依賴的）病毒和/或病原體，其數量足W用于實驗和/或治 療用途(例如，用于疫苗生產）。
[004引因此，在一個實施方案中，本發明提供了從生物組織產生生物基質支架的方法，其 包括如下步驟:a)用第一培養液灌注生物組織或使該生物組織均質化，其中所述第一培養 液的重量摩爾滲透壓濃度是約250m0sm/kg至約350m0sm/kg，W及所述第一培養液是無血清 的且處于中性抑;然后b)在所述第一培養液中用包含脂肪酶和/或去污劑的脫脂緩沖液灌 注步驟(a)的生物組織或提取步驟(a)的勻漿;然后C)用處于中性pH且包含約2.OM化Cl至 約5.OM的鹽濃度的緩沖液灌注步驟(b)的組織或提取步驟(b)的勻漿，選擇所述濃度W保持 生物組織中鑒定的膠原不溶;然后d)在緩沖液中用核糖核酸酶(RNase)和脫氧核糖核酸酶 (面ase)灌注步驟(C)的組織或提取步驟(C)的勻漿；W及然后e)用處于中性抑、無血清、且 具有約250m0sm/kg至約350m0sm/kg重量摩爾滲透壓濃度的第二培養液沖洗步驟(d)的組織 或勻漿，進而從所述生物組織產生完整的或均質化的生物基質支架，所述生物組織支架包 含未處理生物組織的至少95% (例如，80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%)的膠原和 大部分膠原結合基質成分W及基質結合生長因子、激素和細胞因子。本文還提供了通過本 發明的任何方法產生的生物基質支架