性高甲基化標志物SOXl和IRAK3與視場缺陷 低甲基化標志物Ll-MET的組合能夠W高靈敏度和特異性檢測疾病復發。運些結果還表明， 高DNA甲基化和低DNA甲基化之間的平衡對于膀脫癌發生是重要的，運進一步確立了該表觀 遺傳學視場缺陷是參與惡性腫瘤誘因的因子。
[007。實施例4:選定的DNA甲基化標志物可靠地預測了復發且假陽性預測率低(7%)。為 了評估在本發明的縱向研究樣品中所述=標志物模型的甲基化是否預測復發，發明人在每 個于隨訪時獲自90位TURBT患者的尿樣中篩查了 DNA甲基化并計算了風險評分(-0.37608+ 0.17095 X S0X1+0.21604 X IRAK3-0.09887 X L1-MET)。在TURBT后無復發的組（圖2C中報告 的CU樣品）中由SOXl、IRAK3和Ll-MET的組合給出的DNA甲基化風險評分在數月的持續監視 期間都低于闊值（圖3A;患者8617和7789)。相比之下，在腫瘤復發患者組中，DNA甲基化評分 發生了變化且高于闊值（圖3B)。在復發診斷時，還在90%的樣品（34/38)中發現了DNA甲基 化正分。當考慮相同的臨床訪視時，運些標志物的靈敏度優于細胞學（16%)和膀脫鏡檢 (8%)(圖3C)。此外，在復發前(在一些情況下在臨床診斷出復發前至少5個月）收集的尿沉 淀物中，DNA甲基化評分高于闊值（圖3B，患者8928和6804)。為了對運S種標志物的預測值 進行量化，發明人在復發前分析了來自無復發患者的189個樣品和來自最終復發的患者的 65個樣品中的風險評分。通過分析所有樣品（任何時候的訪視），發明人發現在復發組中有 62% (103個尿樣中的64個)具有DNA甲基化正分，而在無復發組中僅4% (189個尿樣中的7 個)具有正分（圖2A、2C、3C)。運代表了在復發前數月或數年檢測到的樣品數量分別比尿細 胞學(6%)和膀脫鏡檢(3%)增加10倍和20倍(圖3C)。此外，發明人的結果顯示，在隨訪期任 何時刻檢測到的具有DNA甲基化正分的71個樣品中，64個獲自最終復發的患者(90%真陽性 預測率，TPR);而在具有負分的221個樣品中，有182個與無復發是相關的（82%真陰性預測 率，TNR)(圖3D)。運些結果證明，所述S標志物模型能夠預測后來的復發，且與細胞學(7%) 或膀脫鏡檢(4%)相比具有明顯高的概率。另一方面，在樣品最初顯示出DNA甲基化正分的 患者中，有47% (34個病例中的16個)后來出現了復發。在運16位患者中，有5位的樣品始終 顯示出正分，2位的樣品顯示出后續的波動結果;而其余9位的樣品在復發前僅有一個收集 點。此外，在56個無復發的對照例中，有4個具有正分測試史(7%)。運些數據突出了在準確 解讀=標志物模型的結果時評分史的重要性。綜上所述，運些結果表明，與細胞學不同，在 早期隨訪時收集的尿沉淀物中檢測的DNA甲基化標志物能夠可靠地預測復發，且假陽性預 測率低(7%)。
[007引實施例5:示例性方法
[0074] A.患者和樣品收集。該研究群體包括正在接受淺表NMIBC TURBT腫瘤復發監視的 患者。在每個可能的臨床隨訪時，從90個此類NMIBC患者獲得尿樣。患者的年齡為41到96歲， 中位數年齡為69歲。在1991至2010年，隨訪時的尿液收集在南加州大學化SC)的Keck醫學院 的泌尿科學系進行，其參照USC Norris綜合癌癥中屯、的制度指導來進行。如果因臨床疑似 復發而認為必要的話，在USC的Keck醫學院的泌尿科學系用化療劑(絲裂霉素）或免疫治療 劑（Bacile Calmette-Guerin;BCG)W常規間隔施用腫瘤切除后的佐劑膀脫內療法。在5至 89個月期間(視患者而定），在不同的隨訪時在患者知情同意的情況下收集了共368個樣品。 尿樣收集的時間線示于圖IA中。所有樣品的臨床病理學特征匯總于表1中。腫瘤復發由W下 手段來確定:活檢或組織學證實的膀脫腫瘤，細胞學或膀脫鏡檢中嚴重的異型或乳頭狀損 傷，或在之前的手術后任何并發的疑似標準。在收集期間，34位患者具有腫瘤復發，而56位 患者到隨后一次隨訪時未被診斷出復發。將34個復發樣品的臨床特征匯總于表2中。在34位 復發患者中，有31位提供了診斷時的尿樣。對人類受試對象進行研究的許可獲自USC Norris綜合癌癥中屯、評審委員會。根據美國癌癥聯合委員會的標準化dge, Byrd等，2010)來 診斷腫瘤，并且基于國際抗癌聯盟的?M分類法來進行分期和分級（Sobin ,Gospodarowicz 等，2009)。
[0075] B.從尿沉淀物中提取DM并用焦憐酸測序進行DNA甲基化分析。將尿樣(約50ml)在 1500g分離10分鐘，并按照之前的報導從尿沉淀物中提取DNA^rie化ich,Weisenbe;rge;r等， 2004)。使用EZ DNA甲基化試劑盒(Zymo Research, Irvine,CA,美國）根據制造商的使用說 明對DNA進行亞硫酸氨鹽轉化。從發明人之前的研究(Wolff,化ihara等，2010)中選出6種 DNA甲基化標志物;使用帶生物素標記的引物(表4)對所關注的區域進行PCR擴增，并用焦憐 酸測序進行分析，焦憐酸測序是用于DNA序列檢測的高通量定量工具。如之前所描述 (胖〇^'，871111等，2010)，使用口59服96(91曰邑611，￥曰1611^曰，〔4，美國）來測量甲基化胞喀晚除 W甲基化和未甲基化胞喀晚總數得到的百分比。
[0076] C.統計學分析。ROC曲線匯總了本發明人的標志物在來自87個獨立樣品的DNA尿沉 淀物中的準確性，運些樣品在最后一次隨訪時選自未復發患者(n = 56)，或選自復發患者第 一次復發時(n = 31)。將具有所有標志物的完整數據的83位患者的子集用來構建多變量預 測模型。發明人使用了逐步式邏輯回歸，基于赤池信息量準則來選擇要加入或減去的變量。 靈敏度和特異性使用5倍交叉驗證對每個數據子分區重復進行模型選擇來估算。隨后用發 明人的數據集中的其余樣品來評估最終模型。對照樣品包括了最后一次隨訪前的訪視，其 時患者未被診斷出患有膀脫癌;病例樣品包括了出現在第一次復發后的復發樣品和患者具 有膀脫癌的最初臨床訪視時的樣品。
[0077] 雖然就具體的示例性實施方式和實施例描述了本發明，應理解的是，本文公開的 實施方式僅出于說明性目的，本領域技術人員可W在不背離由所附權利要求闡明的本發明 的主旨和范圍的情況下做出各種修改和變化。
[0078] 參考文獻
[0079] W下參考文獻W其整體引用并并入本文中。
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