針對膀胱癌的dna甲基化生物標志物的制作方法
【專利說明】針對膀脯癌的DNA甲基化生物標志物
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2013年5月10日遞交的美國專利申請第61/821,838號的優先權，并 將其全部內容通過援引完整地并入本文中。
[0003] 關于受聯邦資助的研發的聲明
[0004] 本發明用美國國家癌癥研究所的基金R01CA083867-PAJ和R01CA123518-GL在政府 支持下做出。政府享有本發明的一定權利。
技術領域
[0005] 本發明設及膀脫癌(包括膀脫癌復發)的非侵入性篩查和診斷領域。
【背景技術】
[0006] 在2011年，膀脫癌是患病率最高的十種男性惡性腫瘤之一，在死亡和新病例方面 分別排第四和第八(Siegel ,Ward等，2011)。最常見的膀脫癌癥狀是血尿，該疾病的常見風 險因素包括吸煙和致癌因子暴露(Morgan和Clark 2010)。非肌肉浸潤性膀脫癌(醒IBC)占 所有病例的80%，并且可W進一步分類為乳頭狀(Ta)、扁平原位癌(Tis)和上皮下結締組織 侵襲型（Tl)損傷。其余病例作為肌肉浸潤性膀脫癌(MIBC)而存在（Sobin，Gospodarowicz 等，2009,Babjulc,化Sterlinck等，2011)。醒IBC當前的一線療法是膀脫腫瘤的經尿道切除 (TURBT);但是，50%的患者在TURBT程序后會復發，最高的復發率出現在具有高風險疾病的 患者中（Mi 11自n-Ro化Iguez ,化自chi Ie-Toniolo等，2000;化el ley ,Mason等，2010)。結果， TURBT患者需要頻繁的監視和終身的保持治療，運使膀脫癌在患者管理方面成為花費最高 的癌癥類型之一。
[0007] 目前監視和治療膀脫癌復發的金標準包括使用膀脫鏡檢和細胞學結合Bacile (^ilmette-Guerin(BCG)免疫療法和化學療法（Morgan 和Clark，2010; Bab化k, Oosterl inck 等，2011)。疾病監視是具有挑戰性的，運是因為膀脫鏡檢具有侵入性特性，運會帶來一定程 度的患病，并且還因為在檢測低級別腫瘤時尿細胞學所展現出的低靈敏度化intula和 化化kainen，2010)。近年來，已致力于發現在用非侵入性方法收集的樣品（例如尿沉淀物） 中的疾病診斷和預后的更好的標志物(Sturgeon ,Duffy等，2010)。膀脫瘤細胞比正常或良 性的膀脫尿路上皮細胞具有更弱的細胞附著性，因此其脫落得更多且可W收集在尿液(尿 沉淀物）中。但是，由于特異性較差，目前提出的標志物都未在常規臨床實踐中采用(Parker 和Spiess ,2011)。因此，亟需發現用來監視TURBT患者復發的可靠標志物，其進而可有助于 便利和改進疾病管理。
[000引最近已提出，尿沉淀物的縱向收集和測試可幫助評估標志物的預后、監視和復發 預測值化0que，Begum等，2006)。通過使用DNA甲基化分析、微衛星標志物和成纖維細胞生長 因子受體3 (FGFR3)突變測定，若干項研究實施了上述方法（氏抑巧始t，化pertan等，2008 ; Zuiverloon,van der Aa等，2010)。雖然運些標志物的靈敏度很高，但它們卻顯示出低特異 性，某些情況下與細胞學的特異性相當（Brems-EskiIdsen,Zieger等，2010)。一種四DNA甲 基化標志物組提供了更好的特異性；但是，其還顯示出較高比例的假陽性結果（33%) (Zuiverloon ,Beukers等，2012)。因此，仍然需要針對膀脫癌和膀脫癌復發的更好、特異性 更高且更準確的測試方法。
【發明內容】
[0009] 本發明的一個目的是提供可用于鑒定膀脫癌已復發的患者的方法、系統和試劑 盒。
[0010] 本發明的另一目的是提供可W用于鑒定有高風險復發膀脫癌的患者的方法、系統 和試劑盒。
[0011] 本發明的另一個目的是提供可用于診斷膀脫癌的方法、系統和試劑盒。
[0012] 本發明的另一個目的是提供可用于使常用于膀脫癌復發管理中的侵入性昂貴程 序的頻率最小化的方法、系統和試劑盒。
[0013] 本發明的另一個目的是提供一種工具，所述工具可用于決定對不具有膀脫癌臨床 證據但仍保留有異常DNA甲基化的患者進行嚴密監視，或用于決定為運些患者提供個體化 治療，因為運些患者可能有高風險復發膀脫癌。
[0014] 本發明的一方面是一種準確度和特異性高的多DNA甲基化生物標志物方法，其用 于膀脫癌和膀脫癌復發的預后、預后及診斷。例如，本發明的一個發現在于，H0XA9、S0X1、 NPY、IRAK3、Z02和Ll-MET的DNA甲基化狀態與復發顯著相關且靈敏度和特異性高（全部^ 0.0 OOl )，包含SOXl、IRAK3和Ll-MET的S標志物特征的復發預測能力遠遠優于細胞學(準確 度90%相比7%)。
[0015]本發明的另一方面是用于篩查患者測試樣品的高甲基化化ypermethy Iated)的 DNA甲基化生物標志物和低甲基化化ypomethy Iated)的DNA甲基化生物標志物的組合。
[0016] 本發明的另一方面是如下發現:來自TURBT患者的尿沉淀物中的DNA甲基化變化能 夠用于檢測早期膀脫癌復發。具體而言，H0XA9、SOXl、NPY、IRAK3、Z02的甲基化(高甲基化標 志物)和Ll-MET的去甲基化(低甲基化標志物)表現出與腫瘤復發的正相關性，且靈敏度和 特異性高(P<〇. OOOl)。在檢測早期復發變化方面，SOXl、IRAK3和Ll-MET標志物的組合提供 了比細胞學和膀脫鏡檢更好的分辨力。本發明的方法、試劑盒和系統提供了用于評估TURBT 患者的具有成本效益的非侵入性方法，如果將該方法應用于臨床環境，其可W有助于延遲 或減少腫瘤復發風險并限制諸如膀脫鏡檢等侵入性程序的使用。
[0017] 本發明的一個實施方式是對受試對象的膀脫癌或膀脫癌復發進行預測、預后和/ 或診斷的方法，所述方法包括：
[0018] 提供來自所述受試對象的測試樣品；
[0019] 測量所述測試樣品中的一種或多種多核巧酸的至少一部分的DNA甲基化水平，所 述一種或多種多核巧酸選自由冊乂49、5(^1、^￥、11?41(3、1^-]\^1'和202組成的組；
[0020] 將所述測試樣品中的所述一種或多種多核巧酸的DNA甲基化水平與基于對照組中 的所述一種或多種多核巧酸的DNA甲基化水平的參比DNA甲基化譜進行比較，所述對照組的 成員具有膀脫癌;和
[0021] 基于所述比較，確定W下（1)、（2)和(3)中的至少一項：（1)膀脫癌是否已復發；（2) 是否存在膀脫癌復發的可能性;和(3)患者是否具有膀脫癌。
[0022] 本發明的另一個實施方式是對受試對象的膀脫癌或膀脫癌復發進行預測、預后 和/或診斷的方法，所述方法包括：
[0023] 提供來自所述受試對象的測試樣品；
[0024] 測量所述測試樣品中的兩種或多于兩種多核巧酸的至少一部分的DNA甲基化水 平，所述兩種或多于兩種多核巧酸選自由冊乂49、50乂1、^￥、1341(3、1^-161'和202組成的組；
[0025] 基于所測量的DNA甲基化水平計算風險評分，
[00%] 將所計算的風險評分與闊值(CUt-Off value)進行比較，所述闊值源自基于從對 照組獲得的一種或多種生物標志物的DNA甲基化水平的參比DNA甲基化譜，所述對照組的成 員具有膀脫癌;和
[0027] 基于所計算的風險評分與所述闊值的比較，確定W下（1)、（2)和（3)中的至少一 項：（1)膀脫癌是否已復發；（2)是否存在膀脫癌復發的可能性;和(3)患者是否具有膀脫癌。
[0028] 本發明的另一實施方式是一種系統，所述系統包括:非暫時性計算機可讀介質，所 述介質包含儲存在其中的計算機可讀程序代碼，所述程序代碼用于使處理器獲得測試樣品 中的H0XA9、SOX1、NPY、IRAK3、L1 -MET和Z02中的一種或多種的測得的DNA甲基化水平;將所 述測試樣品中的所述一種或多種生物標志物的DNA甲基化水平與源自對照組的所述一種或 多種生物標志物的參比DNA甲基化譜進行比較，所述對照組的成員具有膀脫癌。優選的是， 所述系統包括基于所述比較而產生的報告，所述報告提供關于W下（1)、（2)和(3)之一的指 導：（1)膀脫癌是否已復發；（2)是否存在膀脫癌復發的風險;和(3)患者是否具有膀脫癌。
[0029] 本發明的另一實施方式是一種系統，所述系統包括:非暫時性計算機可讀介質，所 述介質包含儲存在其中的計算機可讀程序代碼，所述程序代碼用于使處理器獲得測試樣品 中的H0XA9、SOX1、NPY、IRAK3、L1 -MET和Z02中的兩種或多于兩種的測得的DNA甲基化水平； 計算風險評分;將所述風險評分與闊值進行比較，所述闊值源自基于從對照組獲得的一種 或多種生物標志物的DNA甲基化水平的參比DNA甲基化譜，所述對照組的成員具有膀脫癌。
[0030] 在另一方面，本發明設及一種用于評估膀脫癌復發可能性的診斷性測試。本發明 該方面的診斷性測試通常包括：用于從尿液中提取DNA的尿液處理試劑盒，和特定用于檢測 基本由SOXl、IRAK3和Ll-MET組成的S種生物標志物的組的DNA檢測單元。如下文的說明性 實例所示，可W用本領域已知的任何方法、設備或商購試劑盒來從尿液中提取DNA。所述S 種生物標志的檢測可W用本領域已知的任何DNA甲基化檢測測定、試劑盒、設備來完成，例 如PCR、焦憐酸測序，但不限于此。
[0031] 在另一方面，本發明設及一種監視膀脫癌復發的方法。本發明該方面的方法通常 包括W下步驟:從受試對象獲得尿樣;從所述尿樣中分離出DNA;和分析所述DNA中是否存在 甲基化的基本由SOXl、IRAK3和Ll-MET組成的生物標志物。
[0032] 本發明的其他方面和優點將從W下說明和附圖中變得明顯。
【附圖說明】
[0033] 圖1顯示出，在TURBT患者的尿沉淀物中測試的六種DNA甲基化標志物的組與膀脫 腫瘤的復發正相關，并且具有高靈敏度和特異性。(A)來自腫瘤切除后的膀脫癌患者的縱向 收集的尿沉淀物樣品的時間線。每個患者的起始點由時刻0表示，是指研究中的第一次收集 尿樣的隨訪。用紅色標出的隨訪表示復發時刻。(B)H0XA9、S0X1、NPY、IRAK3、Z02和L1-MET的 接受者操作特性(ROC)曲線是使用第一次復發時的TURBT患者的31個尿沉淀物和來自無復 發患者的最后一次隨訪的56個尿沉淀物制作的。AUC:曲線下面積。（C，D)對TURBT患者的長 期DNA甲基化分析W及其與無復發患者(C)和已復發患者化）的臨床狀態的關系。（-):陰性； (*):疑似；（ + ):陽性(活檢或組織學證實的膀脫腫瘤，在細胞學或膀脫鏡檢中有嚴重的異型 或乳頭狀損傷）；R:復發；BCG:Bacille (Wilmette Guerin。
[0034] 圖2顯示了 =標志物特征在檢測腫瘤復發方面具有高靈敏度和特異性。(A)在最后 一次隨訪時無復發的TURBT患者W及復發的TURBT患者的尿沉淀物中，計算了風險評分:-0.37608+0.17095 X S0X1+0.21604 X IRAK3-0.09887 X L1-MET。（B)五倍交叉驗證顯示出了 86%的靈敏度和89%的特異性。（C)在單獨的尿沉淀物樣品中驗證了該=標志物模型，該樣 品包含來自在最后一次隨訪前無復發的患者的尿沉淀物(CU)和攜帶腫瘤的患者的尿沉淀 物(TU)，并確定了靈敏度和特異性。高于闊值(紅色虛線）的風險評分表示正分，低于闊值的 表示負分。
[0035] 圖3顯示了利用S種DNA甲基化標志物的組合得出的風險評分有助于在尿液中預 測膀脫腫瘤的復發風險。(A，B)使用=標志物組合的DNA甲基化水平來計算兩個單獨的患者 的尿沉淀物樣品中的復發風險評分，所述樣品來自無復發(A)或復發(B)的TURBT患者。V: TURBT手術;R:復發;風險評分= -0.37608+0.17095 X S0X1+0.21604 X IRAK3-0.09887 XLl-MET。紅色虛線表示闊值。澄色箭頭代表復發前的正分。
[0036] 圖4顯示了 S種DNA甲基化標志物的組合有助于在尿沉淀物中預測膀脫腫瘤的復 發風