[0116] (7.3)打開主機和累的開關，確保累設在70(運時緩沖液的流速約1L/分鐘)和緩沖 液在管道中正常循環。
[0117] (7.4)打開冷凝機，確保預設溫度在14°C(緩沖液達到該溫度通常需要20分鐘左 右)。
[0118] (7.5)打開膠槽的旋鈕，取出凝固好的膠，用吸水紙清除膠四周和底面多余的膠， 小屯、的把膠放入電泳槽，關上蓋子。
[0119] (7.6)設置電泳參數:梯度電壓6v/cm;電泳液溫度14°C;電壓角度120%初始轉換 時間2.2s;終末轉換時間：1 Os;初始電流:170mA;運行時間：1化。
[0120] 8、圖像處理：
[0121] (8.1)電泳結束后，關閉儀器。取出膠，放在盛放400mL Ge 1-red溶液的托盤內，染 色20-30分鐘。
[0122] (8.2) W500mL純水脫色每20-30分鐘換一次純水，脫色4次。
[0123] (8.4)用相應軟件對電泳膠塊進行拍照分析。
[0124] 圖1中分別為標準菌株朋812、枯草芽抱桿菌、蘇云金芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌、蠟 樣芽胞桿菌電泳圖。
[0125] 從圖1可W看出采用上述PFGE操作流程能較好的對上述四種革蘭氏陽性菌進行分 子分型。圖樣條帶清晰，可分辨率高。
[0126] 對比例1
[0127] 采用分離純化的枯草芽抱桿菌、蘇云金芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌和蠟樣芽抱桿菌 運四種革蘭氏陽性菌作為分析樣品，選擇常規脈沖場凝膠電泳快速分型方法，包括w下工 藝步驟：
[012引 1、制膠：
[0129] (1.1)菌落液態培養:選用從乳源中分離純化的枯草芽抱桿菌、蘇云金芽抱桿菌、 地衣芽抱桿菌、蠟樣芽胞桿菌菌株挑入培養基中進行液態培養兩天時間。
[0130] (1.2)菌懸液制備:將菌液轉移至有CSB的化Icon管中，調節0D值為4.5即可，再吸 取40化L菌液放置EP管中待用。
[0131] (1.3)溶膠:配置1 %Seakem Gold: 1 %SDS，微波溶解，放置在55°C水浴中待用。
[0132] (1.5)制膠:移液槍吸取40化L膠加入EP管中，用槍頭輕輕吸、吹3次保證混合均勻 (混合時要避免氣泡產生），之后將混合物加入模具加樣孔中。室溫下凝固15min。
[0133] 2、膠塊裂解：
[0134] (2.1)混合裂解液制備:在50mL聚丙締螺帽管中加入:5mL CLB、20化蛋白酶K。
[0135] (2.2)膠塊裂解:將膠塊移入相應管中，做好標記，放入54°C水浴搖床中，水浴4h， 轉速60巧m。
[0136] 3、膠塊清洗：
[0137] (3.1)DD此0清洗:從水浴搖床中拿出螺帽管，蓋上綠色濾帽。輕倒細胞裂解液，在 實驗臺上輕磕使膠塊落在管底。每管中加入10-15mL預熱的DD此0,確保膠塊在液面下而不 在管壁或蓋子上，放回50°C水浴搖床中，搖10-15分鐘。重復3次。
[013引 （3.2) TE緩沖液清洗:50°C水浴預熱TE緩沖液。倒掉DD此0，加入10-15mL預熱的TE， 在50°C的水浴搖床中搖10-15分鐘。倒掉TE，用TE再重復洗5次，每次10 -15分鐘。
[0139] (3.3)倒掉最后一次的TE，加入5-10血TE，繼續下一步的酶切或放在4°C冰箱保存 備用。
[0140] 4、膠塊內DNA酶切：
[0141] (4.1)稀釋緩沖液：W滅菌超純水按表1配制。
[0142] 注意:緩沖液要置于冰上。
[0143] (4.2)在1.51^微量離屯、管上標記好相應的樣品名稱;在每個1.51^微量離屯、管中 加入20化L緩沖液稀釋液。小屯、用小伊從TE中取出膠塊，放在干凈的培養皿上。用刀片切下 2-2.5mm寬的膠塊，放入含緩沖液稀釋液的1.5mL微量離屯、管中。確保膠塊在液面下面。將剩 余的膠塊放回原來的TE中。用同樣的方法處理標準株H9812的膠塊。
[0144] 注意:所切下的膠塊的形狀和大小，取決于灌注電泳膠所用的梳子齒大小。
[0145] (4.3)將管子放在37°C水浴中解育5-10分鐘，或室溫10-15分鐘。
[0146] (4.4)在用稀釋緩沖液解育的過程中，將限制性內切酶Xbal按照表2的比例配制酶 切緩沖液，混勻。
[0147] 注意:將酶液置于冰上，用后立即放回-20°C冰箱保存。
[0148] (4.5)用槍頭吸出緩沖液，避免損傷膠塊。
[0149] (4.6)每管加入20化L混合液，實驗臺上輕磕管子底部，確保膠塊在液面的下面。
[0150] (4.7)在37 °C水浴中解育至少2小時。
[0151] 5、電泳膠制備：
[0152] (5.1)打開水浴箱，溫度調至55-6(TC ;配制2200mL的0.5 X TBE;用0.5 X T肥配制 l%SeaKem Gold(SKG)膠。
[0153] (5.2)烙化時，微波加熱60秒，混合;每隔15-30秒重復一次，直到膠完全烙化。放在 55-60°C水浴箱備用(溫度至少平衡30分鐘W后使用）。
[0154] 6、加樣：
[0155] (6.1)安裝膠槽，調整梳子高度，使梳子齒與膠槽的底面相接觸。用水平儀調整膠 槽使其水平。
[0156] (6.2)把梳子平放在膠槽上，把膠塊加在梳子齒上。
[0157] (6.3)用吸水紙的邊緣吸去膠塊附近多余的液體，在室溫下風干約3分鐘。
[0158] (6.4)把梳子放入膠槽，確保所有的膠塊在同一條直線上，并且膠塊與膠槽的底面 相接觸。從膠槽的下部中央緩慢到入烙化的在55 °C - 60°C平衡的1 % SKG。避免氣泡的生成； 在室溫下凝固30分鐘左右。記錄加樣順序。
[0159] 7、電泳條件設置：
[0160] (7.1)調整電泳槽水平。
[0161] (7.2)加入2-2.化新配制的0.5 X T邸緩沖液，關上蓋子。
[0162] (7.3)打開主機和累的開關，確保累設在70(運時緩沖液的流速約1L/分鐘)和緩沖 液在管道中正常循環。
[0163] (7.4)打開冷凝機，確保預設溫度在14°C(緩沖液達到該溫度通常需要20分鐘左 右)。
[0164] (7.5)打開膠槽的旋鈕，取出凝固好的膠，用吸水紙清除膠四周和底面多余的膠， 小屯、的把膠放入電泳槽，關上蓋子。
[0165] (7.6)設置電泳參數:梯度電壓6v/cm;電泳液溫度14°C;電壓角度120%初始轉換 時間2.2s;終末轉換時間：63.8s;初始電流:170mA;運行時間：1化。
[0166] 8、圖像處理：
[0167] (8.1)電泳結束后，關閉儀器。取出膠，放在盛放400mL Ge 1-red溶液的托盤內，染 色20-30分鐘。
[0168] (8.2) W500mL純水脫色每20-30分鐘換一次純水，脫色4次。
[0169] (8.4)用相應軟件對電泳膠塊進行拍照分析。
[0170] 圖2中分別為標準菌株朋812、枯草芽抱桿菌、蘇云金芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌、蠟 樣芽胞桿菌電泳圖。
[0171] 從圖2可W看出采用上述PFGE操作流程不能較好的對上述四種革蘭氏陽性菌進行 分子分型。圖樣條帶不清晰，可分辨率低。
[0172] 對比例2
[0173] 采用分離純化的枯草芽抱桿菌、蘇云金芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌和蠟樣芽抱桿菌 運四種革蘭氏陽性菌作為分析樣品，選擇常規脈沖場凝膠電泳快速分型方法，包括W下工 藝步驟：
[0174] 1、制膠；
[0175] (1.1)菌落液態培養:選用從乳源中分離純化的枯草芽抱桿菌、蘇云金芽抱桿菌、 地衣芽抱桿菌、蠟樣芽胞桿菌菌株挑入培養基中進行液態培養兩天時間。
[0176] (1.2)菌懸液制備:將菌液轉移至有CSB的化Icon管中，調節0D值為4.5即可，再吸 取40化L菌液放置EP管中待用。
[0177] (1.3)溶膠:配置1 %Seakem Gold: 1 %SDS，微波溶解，放置在55°C水浴中待用。
[017引（1.5)制膠:移液槍吸取40化L膠加入EP管中，用槍頭輕輕吸、吹