一種乳源革蘭氏陽性菌的脈沖場凝膠電泳分型方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物技術領域，特別設及一種乳源革蘭氏陽性菌的脈沖場凝膠電泳分 型方法。
【背景技術】
[0002] 脈沖場凝膠電泳(PFGE，化Ised Field Gel Electrophoresis)是一種分離大分子 DNA的方法。在普通的凝膠電泳中，大的DNA分子(〉10化)移動速度接近，很難分離形成足W 區分的條帶。在脈沖場凝膠電泳中，電場不斷在兩種方向（有一定夾角，而不是相反的兩個 方向）變動。DNA分子帶有負電荷，會朝正極移動。相對較小的分子在電場轉換后可W較快轉 變移動方向，而較大的分子在凝膠中轉向較為困難。因此小分子向前移動的速度比大分子 快。脈沖場凝膠電泳可W用來分離大小從10化到10Mb的DNA分子。現今，PFGE作為一種基因 分型技術得到廣泛的應用。目前，較多關于PFGE的應用集中在致病菌基因分型W及溯源方 面，而從已有的報道看出運些致病菌大多為革蘭氏陰性菌，鮮有關于PFGE在革蘭氏陽性菌 應用中的報道。
[0003] 革蘭氏陽性菌大部分為耐熱芽抱桿菌，運些耐熱芽抱桿菌在食品尤其是乳制品生 產中會造成重大損失。主要在乳制品企業生產中表現在耐受傳統的己氏殺菌(72°C/15s)， 有些甚至能耐受超高溫殺菌(UHT，140-145°C/2-5s)而存活下來，對生產加工甚至最終產品 有重要影響。例如，枯草芽抱桿菌對特殊菌體進行促芽抱和微膠囊包被處理，在抱子狀態下 穩定性好，能耐氧化;耐擠壓;耐高溫，能長期耐60°C高溫，在120°C溫度下能存活20分鐘。
[0004] 目前，適合于革蘭氏陰性菌的PFGE技術無法對革蘭氏陽性菌進行準確的基因分 型，PFGE在乳源革蘭氏陽性菌研究尚未有研究。因此，開展乳源革蘭氏陽性菌PFGE研究應用 一方面能為運類菌進行基因分型；另一方面能進行溯源研究，控制耐熱芽抱菌對生產加工 和廣品影響，減少企業損失。
【發明內容】
[0005] 有鑒于此，本發明提供了一種乳源革蘭氏陽性菌的脈沖場凝膠電泳分型方法。該 脈沖場凝膠電泳分型方法可對乳源革蘭氏陽性菌進行準確分型。
[0006] 為了實現上述發明目的，本發明提供W下技術方案：
[0007] 本發明提供了一種乳源革蘭氏陽性菌的脈沖場凝膠電泳分型方法，包括如下步 驟：
[000引將乳源革蘭氏陽性菌裂解、DNA酶切后，采用脈沖場凝膠電泳技術對DNA片段進行 分離，所述脈沖場凝膠電泳的初始轉換時間為1.8~2.5s，終末轉換時間為8~1 Os。
[0009] 在本發明提供的一些實施例中，脈沖場凝膠電泳技術的初始轉換時間為2.2s，終 末轉換時間為10s。
[0010] 作為優選，脈沖場凝膠電泳的梯度電壓為5~7V/cm，電泳液溫度為12~16°C，電壓 角度為100°~120°，初始電流為140~170mA。
[0011] 在本發明提供的一些實施例中，脈沖場凝膠電泳技術的梯度電壓為6V/cm，電泳液 溫度為14°C，電壓角度為120°，初始電流為170mA。
[0012] 作為優選，脈沖場凝膠電泳的運行時間為15~16h。
[0013] 在本發明提供的一些實施例中，脈沖場凝膠電泳運行時間為15h。
[0014] 作為優選，裂解采用的裂解液為細胞裂解液、蛋白酶K和溶菌酶的混合物。
[0015]作為優選，隊吐/mg/mg計，細胞裂解液、蛋白酶K與溶菌酶的用量為5: (1~3): (7~ 9)。
[0016] 優選地，WmL/mg/mg計，細胞裂解液、蛋白酶K與溶菌酶的用量為5:2:8。
[0017] 作為優選，裂解采用的裂解液與乳源革蘭氏陽性菌的菌懸液的體積比為（40~ 60):4，乳源革蘭氏陽性菌的菌懸液的0D值為4~5。
[0018] 優選地，裂解采用的裂解液與乳源革蘭氏陽性菌的體積比為51:4,乳源革蘭氏陽 性菌的菌懸液的0D值為4~4.5。
[0019] 作為優選，裂解的溫度為50~55°C，時間為2~化，轉速為50~70巧m。
[0020] 優選地，裂解的溫度為54°C，時間為地，轉速為60巧m。
[0021] 作為優選，DM酶切采用的限制性內切酶為Xbal內切酶。
[0022] 在本發明提供的一些實施例中，DNA酶切的溫度為37°C，時間為2~地。
[0023] 作為優選，將乳源革蘭氏陽性菌裂解之前還包括初步裂解的步驟，初步裂解采用 的裂解液為細胞裂解液、蛋白酶K和溶菌酶的混合物。
[0024] 作為優選，WmL/mg/mg計，初步裂解中，細胞裂解液、蛋白酶K與溶菌酶的用量為1: (4~6):(18~22)。
[002引優選地，WmL/mg/mg計，初步裂解中，細胞裂解液、蛋白酶K與溶菌酶的用量為1:5: 20 0
[0026] 作為優選，初步裂解中，裂解采用的裂解液與乳源革蘭氏陽性菌的菌懸液的體積 比為(4~6): 4，乳源革蘭氏陽性菌的菌懸液的0D值為4~5。
[0027] 優選地，初步裂解中，裂解采用的裂解液與乳源革蘭氏陽性菌的體積比為5:4,乳 源革蘭氏陽性菌的菌懸液的0D值為4.5。
[002引作為優選，初步裂解的溫度為36~38°C，時間為30~50min。
[0029] 優選地，初步裂解的溫度為37°C，時間為30min。
[0030] 在本發明提供的一些實施例中，乳源革蘭氏陽性菌為枯草芽抱桿菌、蘇云金芽抱 桿菌、地衣芽抱桿菌或蠟樣芽抱桿菌中的一種或幾種。
[0031] 在本發明提供的一些實施例中，乳源革蘭氏陽性菌的脈沖場凝膠電泳分型方法包 括如下步驟：
[0032] 1、初步裂解：
[00削向400化乳源革蘭氏陽性菌的菌懸液中加入:細胞裂解液、蛋白酶K、溶菌酶，W體 積:0的十，細胞裂解液、蛋白酶K、溶菌酶，用量分別為400μLν(4~5)、20μLν(4~5)、80μLν (4 ~5)，放入37°C水浴30min。
[0034] 2、制膠：
[0(X3日]配置1 % Seakem Go 1 d: 1 % SDS，微波溶解，放置在55 °C水浴中待用；將制得的膠與 菌液混合均勻，混合時避免氣泡產生，凝固，得到膠塊。
[0036] 3、裂解：
[0037] 混合裂解液制備:細胞裂解液、蛋白酶Κ、溶菌酶，W體積:OD計，細胞裂解液、蛋白 酶K、溶菌酶，用量分別為5mL/(4~5)、20μLν(4~5)、80μLν(4~5)。膠塊裂解:將膠塊與混合 裂解液混合，54 °C水浴4h，轉速60巧m。
[0038] 4、膠塊清洗：
[0039] 包括孤出0清洗、TE緩沖液清洗。
[0040] 5、膠塊內DNA酶切：
[0041 ] 采用Xbal內切酶對膠塊內DNA進行酶切，在37 °C水浴中解育2~4小時。
[0042] 6、電泳：
[0043] 配制l%SeaKem Gold(SKG)膠、加樣、電泳；
[0044] 電泳條件設置:梯度電壓為6V/cm，電泳液溫度為14°C，電壓角度為120°，初始轉換 時間為2.2s，終末轉換時間為1 Os，初始電流為170mA，運行時間為15h。
[0045] 7、圖像處理：
[0046] 電泳結束后，取出膠，染色，脫色，對電泳膠塊進行拍照。
[0047] 在本發明提供的另一些實施例中，乳源革蘭氏陽性菌的脈沖場凝膠電泳分型方法 包括如下步驟：
[004引 1、初步裂解：
[0049]向400化乳源革蘭氏陽性菌的菌懸液中加入體積:〇的十，細胞裂解液、蛋白酶K、 溶菌酶，用量分別為400μ^ 4.5、20μL74.5、80μL74.5，放入 37 °C 水浴 30min。
[00加]2、制膠：
[0051 ] 配置1 % Seakem Go 1 d: 1 % SDS，微波溶解，放置在55 °C水浴中待用；將制得的膠與 菌液混合均勻，混合時避免氣泡產生，凝固，得到膠塊。
[0052] 3、裂解：
[0053] 混合裂解液制備：W體積:0D計，細胞裂解液、蛋白酶K、溶菌酶，用量分別為5mL/ 4.5、20yL/4.5、80yL/4.5;
[0054] 膠塊裂解:將膠塊與混合裂解液混合