爾森菌（Yersinia pestis)(P14-)。在一些實施例中，靴核酸存于選自W下的細菌屬物質中：不動桿菌屬、氣球 菌屬（Aerococcus )、擬桿菌屬（Bacteroides )、博德特菌（Bordetel la)、彎曲桿菌屬 (Campylobacter)、梭狀芽抱桿菌屬（Clostridium)、棒狀桿菌屬（Corynebacterium)、衣原 體（Chlamydia )、梓樣酸桿菌屬（Citrobac ter )、腸桿菌屬化η terobac ter )、腸球菌屬 (Enterococcus)、埃希氏菌屬化scherichia)、螺旋桿菌屬化elicobacter)、嗜血桿菌屬 化aemophilus)、克雷伯氏桿菌屬（Klebsiella)、軍團菌屬化egionella)、李斯或氏菌屬 (Listeria)、微球菌屬（Micrococcus)、動彎桿菌（Mobilincus)、莫控菌屬（Moraxella)、分 枝桿菌屬（Mycobacterium)、支原體、奈瑟球菌、寡源桿菌屬（01 igel la)、己斯德菌屬 (Pasteurella)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、紅棟色單胞菌屬(Po巧hyromonas)、假單胞菌 屬（Pseudomonas)、丙酸桿菌屬（Propioni^bacterium)、變形菌屬（Proteus)、沙口 氏菌屬、粘 質沙雷菌屬（Serratia)、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、密螺旋體屬（Treponema)、芽胞桿菌屬 (Bacillus)、弗朗西絲氏菌屬(Francisella)或耶爾森菌屬(Yersinia)。在一些實施例中， 在A組鏈球菌或B組鏈球菌中發現祀核酸。
[0057]例示性衣原體祀核酸包括在衣原體隱性質粒上發現的序列。
[005引例示性結核分枝桿菌(M. tuberculosis)勒1核酸包括于IS6110(參見US 5,731, 150)和/或151081(參見己哈德（83}13(100等人，2005，農業生物科學研究雜志 (Res.J.Agr.Biol.Sci. ),1:142-145)中發現的序列。
[0059] 例示性奈瑟氏淋病雙球菌祀核酸包括于NG00469 (參見皮耶卡羅維奇 (Piekarowicz)等人，2007，BMC微生物(BMC Microbiol. )7:66)和NG00470中發現的序列。
[0060] 例示性A組鏈球菌祀核酸包括于Spyl258(參見劉化iu)等人，2005,微生物研究 (Res .Microbiol )，156:564-567)、Spy0193、l5rtA、psaA和參見US 2010/02:34245)中發 現的序列。
[0061 ]例示性Β組鏈球菌祀核酸包括于cfb基因（參見波德別爾斯基(Podbielski)等人， 1994,微生物與免疫醫學雜志(Med.Microbiol. Immunol .)，183:239-256)中發現的序列。
[0062] 在一些實施例中，祀核酸是病毒核酸。例如，可在人類免疫缺陷病毒化IV)、流感病 毒或登革病毒中發現病毒核酸。例示性HIV祀核酸包括于化1區域中發現的序列。
[0063] 在一些實施例中，祀核酸是原生動物核酸。例如，可在追原蟲屬（Plasmodium spp.)、利什曼原蟲屬化eishmania spp.)、岡比亞布氏錐蟲（Trypanosoma brucei gambiense)、羅德西亞布氏錐蟲（Trypanosoma brucei rhodes i ense )、克氏錐蟲 (TiTpanosoma cruzi)、內阿米己屬巧ntamoeba spp.)、弓形蟲屬（Toxoplasma spp.)、陰道 毛滴蟲（Trichomonas vaginalis)和腸形鞭毛蟲(Giardia duodenalis)中發現原生動物核 酸。
[0064] 在一些實施例中，祀核酸是哺乳動物(例如，人類)核酸。例如，可在循環腫瘤細胞、 上皮細胞或成纖維細胞中發現哺乳動物核酸。
[0065] 在一些實施例中，祀核酸是真菌（例如，酵母)核酸。例如，可在念珠菌屬(Candida spp .)(例如，白色念珠菌）中發現真菌核酸。
[0066] 檢測擴增產物通常包括使用經標記探針，其足夠互補且與對應于祀核酸的擴增產 物雜交。因此，可通過使與擴增產物互補的經標記探針(例如巧光標記探針）雜交來檢測擴 增產物的存在性、量和/或特性。在一些實施例中，目標祀核酸序列的檢測包括組合使用等 溫擴增方法和經標記探針，W便實時測量產物。在另一實施例中，目標擴增祀核酸序列的檢 巧。包括將擴增祀核酸轉移到固體載體(例如膜），和用與擴增祀核酸序列互補的探針(例如 經標記探針)探測膜。在又一實施例中，目標擴增祀核酸序列的檢測包括將經標記擴增祀核 酸與探針雜交，所述探針W具有可尋址位置的預定陣列排列且與擴增祀核酸互補。
[0067] 通常，擴增反應中利用一種或一種W上引物。祀核酸的擴增設及使祀核酸與一種 或一種W上引物接觸，所述引物能夠使祀核酸雜交并引導祀核酸擴增。在一些實施例中，使 試樣與一對引物接觸，所述引物包括均與祀核酸雜交的正向和反向引物。
[0068] 實時擴增監測反應期間發射的巧光作為與終點檢測相反的擴增子產生的指示物。 可在一些系統中觀察反應的實時進展。通常，實時方法設及巧光報告子的檢測。通常，巧光 報告子的信號與反應中擴增產物的量成正比例增加。通過記錄每一循環時巧光發射的量， 可監測指數期期間的擴增反應，其中擴增產物的量的首次顯著增加與祀模板的初始量相 關。核酸祀標的起始拷貝數越高，就越快觀察到巧光顯著增加。
[0069] 在一些實施例中，巧光標記的探針取決于試樣的巧光共振能量轉移(FRET)或巧光 發射波長變化，其作為實時檢測DNA探針與擴增祀核酸雜交的方法。例如，在不同探針（例 如，使用HybProbes)上的巧光標記間或在相同探針（例如，使用分子信標或TAQMAN?探 針)上的巧光團與非巧光巧滅劑間發生的FRET可辨別與目標DNA序列特異性雜交且W此方 式可檢測試樣中祀核酸的存在性和/或量的探針。在一些實施例中，用于辨別擴增產物的巧 光標記的DNA探針具有光譜差異發射波長，由此可在同一反應管內（例如在多工反應中）對 其加 W區分。例如，多工反應容許同時檢測兩種或兩種W上祀核酸、甚至另一核酸(例如對 照核酸)的擴增產物。
[0070] 在一些實施例中，利用同位素或非同位素標記W可檢測方式標記對祀核酸具有特 異性的探針;在替代實施例中，標記擴增祀核酸。探針可檢測為祀核酸物質（例如祀核酸物 質的擴增產物）的指示物。非同位素標記可(例如)包含巧光或發光分子、或酶、輔因子、酶底 物或半抗原。可將探針與RNA、DNA的單鏈或雙鏈制劑或二者的混合物一起培育，并測定雜 交。在一些實例中，雜交導致(例如）經標記探針的可檢測的信號變化，例如信號增加或減 少。因此，檢測雜交包含檢測雜交期間或之后的經標記探針的信號相對于雜交之前的標記 的信號的變化。
[0071] 在一些方法中，可使用試紙條(flow strip)檢測擴增產物。在一些實施例中，一種 可檢測標記產生顏色且第二標記是由固定抗體識別的表位。含有兩種標記的產物將附接到 固定抗體且在固定抗體的位置處產生顏色。基于此檢測方法的分析可為(例如)可施加到整 個等溫擴增反應的試紙條(浸量尺）。陽性擴增將在試紙條上產生帶，作為祀核酸物質擴增 的指示物，而陰性擴增將不產生任何彩色帶。
[0072] 在一些實施例中，可使用本文所掲示的方法對祀核酸的量(例如，拷貝數)進行近 似定量。例如，可在平行反應中使已知量的祀核酸擴增且可比較從試樣獲得的擴增產物的 量與在平行反應中獲得的擴增產物的量。在一些實施例中，可在多重平行反應中使若干已 知量的祀核酸擴增且可比較從試樣獲得的擴增產物的量與在平行反應中獲得的擴增產物 的量。假定試樣中的祀核酸與平行反應中的祀核酸W類似方式可為反應組份所利用，那么 可使用所述方法對試樣中的祀核酸的量進行近似定量。
[0073] 本文所掲示方法的反應組份可W用于檢測祀核酸的試劑盒的形式供應。在所述試 劑盒中，適當量的一種或一種W上反應組份提供于一個或一個W上容器中或固持在襯底 上。還可提供對祀核酸具有特異性的核酸探針和/或引物。例如，反應組份、核酸探針和/或 引物可懸浮于水溶液中或呈冷凍干燥或凍干粉末、丸粒或珠粒形式。供應所述組份等的容 器可為能夠保持所供應形式的任何常規容器，例如，微量離屯、管、安飯瓶，或小瓶或綜合測 試裝置，例如微流體裝置、側向流動或其它類似裝置。試劑盒可包括經標記或未經標記的核 酸探針，W用于檢測祀核酸。在一些實施例中，試劑盒可進一步包括在本文所述方法(例如， 使用粗基質而不進行核酸提取和/或純化的方法）中使用所述組份的說明書。
[0074] 在一些應用中，一種或一種W上反應組份可W預先測量的一次使用量提供于個 另IJ、通常一次性管或等效容器中。利用所述布置，可向個別管中添加待測試祀核酸的存在性 的試樣并直接實施擴增。
[0075] 試劑盒中供應的組份的量可為任何適當量，且可取決于產品所針對的目標市場。 用于測定適當量的一般指南可參見音尼斯（Innis)等人、薩姆布魯克（Sambrook)等人和奧 蘇伯爾(Ausubel)等人。
[0076] 實例
[0077] 實例1.粗基質中的細菌的檢測
[0078] 研究擴增粗試樣中的核酸的能力。使鼠傷寒沙口氏菌在LB培養液中生長。將指數 期中期培養物稀釋到化1中100c化、1000c化或10，000c化。通過將試樣與2.扣1 0.2化0H、 0.1 %曲拉通(Triton)X-100混合5分鐘來使稀釋的培養物裂解，之后用化1 1M乙酸中和。將 對照培養物(未裂解)與再懸浮緩沖液混合用于擴增。使用200個拷貝的invA PCR產物作為 陽性對照，且使用LB培養基作為陰性對照。向每一試樣中添加正向和反向擴增引物 (INVAF2，ccgtggtccagtttatcgttattaccaaaggt，SEQ ID N0:1，和INVAR2， ccctttccagtacgcttcgccgttcgcgcgcg，沈 Q ID NO:2)的 6μΜ 溶液各 3.?5μ1;8.扣 1 2〇%PEG 35Κ;2.5μ1 乙酸儀（280mM);含有 1.25yg肌酸激酶、2：3yg UvsX、化g UvsY、24.2化g Gp32、 6.6化gExoIII、14.6扣gPolI、PEG 35000(最終濃度為5.5%w/v)、Tris抑8.3(最終濃度 為50mM)、DTT(最終濃度為5mM)、憐酸肌酸(最終濃度為50mM)、ATP(最終濃度為2.5mM)、海藻 糖（最終濃度為5.7%w/v)和dNTP(各自最終濃度為300mM)的凍干反應丸粒；檢測探針 attttctct 邑邑 at 邑邑 tat 邑 CCC 邑邑 taaaca 邑 aQ 邑 H邑 Fatt 邑 at 邑 CC