粗基質中的核酸的檢測的制作方法
【專利說明】
[0001 ]本申請是中國發明專利申請，【申請號】201080042456.4,題目：粗基質中的核酸的 檢測的分案申請。
[000。相關申請案交叉參考
[0003] 本申請案主張于2009年9月25日提出申請的美國專利公開案第61/245,758號的優 先權，所述案件的全部內容W引用方式并入本文中。
技術領域
[0004] 本掲示內容設及通過擴增方法檢測粗基質中的核酸。
【背景技術】
[0005] 等溫擴增方法能夠使核酸祀標在幾分鐘內W特異性方式從痕量水平擴增到極高 且可檢測水平。所述等溫方法(例如重組酶聚合酶擴增(RPA))可使基于核酸的診斷的應用 擴大到例如重點照護測試與現場和消費者測試(field and consumer testing)等新興領 域。所述技術的等溫和寬溫度范圍可允許用戶避免使用復雜的需求電力的儀器。
【發明內容】
[0006] 本發明至少部分是基于W下發現:可不進行核酸提取和/或純化在粗基質中檢測 各種病原性有機體。使用粗基質不進行核酸提取和/或純化可為上述等溫核酸擴增方法的 優點增加簡單試樣制備的優點。在一些情形下，簡單處理(例如堿裂解或裂解酶處理)對于 檢測即足夠。在一些其它情形下，可W高敏感性檢測有機體的祀核酸序列，而無利用常規裂 解溶液預處理試樣的任何需要。相反，使試樣與等溫擴增反應接觸可足夠W高敏感性檢測 有機體。
[0007] 在一個方面中，本掲示內容的特征在于包括W下的方法:使粗基質與祀核酸物質 的等溫核酸擴增反應的組份接觸，由此提供混合物;在足W進行等溫核酸擴增反應的條件 下培育所述混合物，由此提供產物;和確定所述產物中是否存在所述祀核酸物質的指示物。 [000引在另一方面中，本掲示內容的特征在于包括W下的方法:使粗基質與祀核酸物質 的核酸擴增反應的組份接觸，由此提供混合物;將所述混合物在低于95°C (例如，低于90°C、 低于85°C、低于80°C、低于75°C、低于70°C、低于65°C、低于60°C、低于55°C、低于50°C、低于 45Γ或低于4(TC)的溫度下維持足W進行核酸擴增反應的時間，由此提供產物;和確定所述 產物中是否存在所述祀核酸物質的指示物。
[0009] 在另一方面中，本掲示內容的特征在于包括W下的方法:使粗基質與祀核酸物質 的核酸擴增反應的組份接觸，由此提供混合物；將所述混合物的攝氏溫標溫度改變小于 30% (例如，小于25%、小于20%、小于15%、小于10%或小于5%)或小于20°C (例如，小于15 °C、小于10°C、小于5°C、小于2°C或小于rC)達足W進行核酸擴增反應的時間，由此提供產 物;和確定所述產物中是否存在所述祀核酸物質的指示物。
[0010] 在另一方面中，本掲示內容的特征在于包括W下的方法:實施混合物的等溫反應 w提供產物，所述混合物包含粗基質和祀核酸物質的核酸擴增反應的組份;和確定所述產 物中是否存在所述祀核酸物質的指示物。
[0011] 在另一方面中，本掲示內容的特征在于包括W下的方法:使混合物在最高80°C (例 如，最高75°C、最高70°C、最高65°C、最高60°C、最高55°C、最高50°C、最高45°C或最高40°C) 的溫度下反應W提供產物，所述混合物包含粗基質和祀核酸物質的核酸擴增反應的組份； 和確定所述產物中是否存在所述祀核酸物質的指示物。
[0012] 在另一方面中，本掲示內容的特征在于包括W下的方法:使混合物反應，同時將混 合物的攝氏溫標溫度改變至多30% (例如，至多25%、至多20%、至多15%、至多10%或至多 5%)或至多20°C (例如，至多15°C、至多10°C、至多5°C、至多2°C或至多rC似提供產物，所 述混合物包含粗基質和祀核酸物質的核酸擴增反應的組份;和確定所述產物中是否存在所 述祀核酸物質的指示物。
[001引在上述方面的一些實施例中，粗基質包括生物試樣，例如血液、尿、唾液、疲、淋己、 血漿、精液、肺吸出物和腦脊液中的至少一者。在一些實施例中，生物試樣包括至少一種選 自由W下組成的群組的試樣：咽拭子、鼻拭子、陰道拭子或直腸拭子。在一些實施例中，生物 試樣包含活檢試樣。
[0014] 在上述方面的一些實施例中，粗基質未經受裂解處理。
[0015] 在上述方面的一些實施例中，粗基質未用離液劑、洗涂劑或裂解酶制劑處理。
[0016] 在上述方面的一些實施例中，粗基質未經受高溫(例如，80°C或更高、85°C或更高、 90°C或更高或95°C或更高)熱處理步驟。
[0017] 在上述方面的一些實施例中，粗基質未經受裂解處理且祀核酸物質是葡萄球菌 (例如，金黃色葡萄球菌或耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA))核酸。
[0018] 在上述方面的一些實施例中，粗基質未經受裂解處理且祀核酸物質是支原體核 酸。
[0019] 在上述方面的一些實施例中，粗基質可經受裂解處理。例如，用洗涂劑和/或裂解 酶(例如隧菌體溶菌素(例如，鏈球菌Cl隧菌體溶菌素 (PlyC)))處理粗基質。
[0020] 在上述方面的一些實施例中，粗基質經受裂解處理且祀核酸物質是鏈球菌(例如， A組鏈球菌或B組鏈球菌)核酸。
[0021] 在上述方面的一些實施例中，粗基質經受裂解處理且祀核酸物質是沙口氏菌（例 如，鼠傷寒沙口氏菌)核酸。
[0022] 在上述方面的一些實施例中，祀核酸是來自（例如)選自W下的細菌或來自本文所 述另一細菌的細菌核酸:沙眼衣原體、奈瑟氏淋病雙球菌、A組鏈球菌、B組鏈球菌、難辨梭狀 芽抱桿菌、埃希氏大腸桿菌、結核分枝桿菌、幽口螺桿菌、陰道加德納氏菌、人型支原體、活 動彎曲桿菌屬、普雷沃氏菌屬和紅棟色單胞菌屬。
[0023] 在上述方面的一些實施例中，祀核酸是哺乳動物核酸，例如核酸與腫瘤細胞有關。
[0024] 在上述方面的一些實施例中，祀核酸是(例如)來自HIV、流感病毒或登革病毒或來 自本文所述另一病毒的病毒核酸。
[0025] 在上述方面的一些實施例中，祀核酸是(例如)來自白色念珠菌或本文所述另一真 菌的真菌核酸。
[0026] 在上述方面的一些實施例中，祀核酸是(例如)來自毛滴蟲或本文所述另一原生動 物的原生動物核酸。
[0027]在上述方面的一些實施例中，等溫核酸擴增反應是重組酶聚合酶擴增。在一些實 施例中，等溫核酸擴增反應是轉錄介導的擴增、基于核酸序列的擴增、信號介導的RNA擴增、 鏈置換擴增、滾環擴增、環介導的DNA等溫擴增、等溫多重置換擴增、解鏈酶依賴性擴增、單 引物等溫擴增、環解鏈酶依賴性擴增或切口和延長擴增反應。
[00%]在上述方面的一些實施例中，反應條件包含（例如）濃度大于1 %的聚乙二醇 (PEG)o
[0029] 在另一方面中，本掲示內容的特征在于檢測特定DM或RNA物質的方法，其中使試 樣在未經離液劑、洗涂劑先前裂解處理、無高溫熱處理步驟或裂解酶制劑的情況下與反應 再水合緩沖液或水合反應系統接觸，并且擴增到可檢測水平。在一些實施例中，祀核酸物質 包括金黃色葡萄球菌或MRSA的基因組DNA。在一些實施例中，擴增方法是重組酶聚合酶擴增 (RPA)方法。在一些實施例中，再水合緩沖液或完全再水合擴增環境中包括濃度大于1%的 聚乙二醇。
[0030] 在另一方面中，本掲示內容的特征在于包括等溫核酸擴增反應的組份和裂解酶的 試劑盒。等溫核酸擴增反應的組份可包括(例如)重組酶。在一些實施例中，裂解酶包括隧菌 體溶菌素，例如鏈球菌Cl隧菌體溶菌素(PlyC)。
[0031] 在另一方面中，本掲示內容的特征在于包括等溫核酸擴增反應的組份和側向流動 或微流體裝置(例如，用于檢測反應產物）的試劑盒。等溫核酸擴增反應的組份可包括（例 如)重組酶。
[0032] 在另一方面中，本掲示內容的特征在于包括等溫核酸擴增反應的組份和拭子(例 如，用于獲得生物試樣)的試劑盒。等溫核酸擴增反應的組份可包括(例如)重組酶。
[0033] 在上述試劑盒中任一者的一些實施例中，試劑盒不包括用于核酸純化或提取的試 劑，例如離液劑和/或核酸結合介質。
[0034] 如本文所用"粗基質"是包括來自生物來源的核酸的基質，其中基質未經受核酸提 取和/或純化。在一些實施例中，生物來源包括細胞和/或生物試樣(例如，來自患者)和/或 環境試樣。細胞和/或生物試樣和/或環境試樣可未裂解或經受裂解步驟。
[0035] 除非另有說明，否則本文所用所有技術和科學術語皆具有與所屬領域技術人員通 常所了解的含義相同的含義。盡管在本發明的實踐或測試中可使用與彼等本文所述者類似 或等效的方法和材料，但下文仍對適宜方法和材料加 W闡述。本文所提及的所有出版物、專 利申請案、專利和其它參考文獻的全部內容都W引用方式并入本文中。如果出現沖突，則W 本說明書(包括定義)為準。此外，材料、方法和實例僅具有闡釋性而非限制性。
[0036] 本發明的其它特征和優點從下列實施方式和權利要求書將顯而易見。
【附圖說明】
[0037] 圖1A-B是繪示10，000cfu、lOOOcfu和lOOcfu鼠傷寒沙口氏菌在未裂解下（1A)或堿 裂解之后（1B)檢測的線形圖。
[0038] 圖2是繪示未裂解(無裂解）、用變溶菌素和溶菌酶(ML/LZ)處理、用PlyC(PLYC)處 理或用變溶菌素、溶菌酶和PlyC(ML/LZ/PLYC)處理的Strep A的檢測的線形圖。
[0039] 圖3是繪示用0、1、2或3個單位溶葡萄球菌素處理的患者試樣中的金黃色葡萄球菌 的檢測的線形圖。
[0040] 圖4是繪示煮沸45分鐘（煮沸）、用溶葡萄球菌素處理并煮沸5分鐘（溶葡萄球菌 素）、或于室溫下在水中培育45分鐘的患者試樣中的金黃色葡萄球菌的檢測的線形圖。將試 樣與具有50或1000個祀核酸拷貝的陽性對照比較。
[0041] 圖5是繪示未裂解(Unlysed)或用溶葡萄球菌素裂解并提取(清潔）的患者試樣中 的金黃色葡萄球菌的檢測的線形圖。將試樣與具有50或1000個祀核酸拷貝的陽性對照進行 比較。
[0042] 圖6是繪示未裂解的耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)試樣的檢測的線形圖， 所述試樣具有約10個有機體(10個細菌)或約100個有機體(100個細菌）。將試樣與具有50個 祀核酸拷貝（50個PCT產物拷貝）的陽性對照或作為陰性對照(NTC)的水進行比較。
[0043] 圖7是繪示50cfu、100c化或lOOOcfu未裂解支原體或培養基對照的檢測的線形圖。
【具體實施方式】
[0044] 本發明提供粗基質中的核酸的等溫擴增方法，其用于檢測核酸祀標。
[0045] 在一些實施例中，使粗基質與祀核酸物質的等溫核酸擴增反應(例如，RP