度設2個平行復孔，蓋好封板膜，37°C水平放 置1. 5小時。洗涂液重復洗板3遍后，加入HRP標記的親和素，室溫（20±5°C )避光放置 45分鐘。洗涂液重復洗板5遍，在吸水紙上盡量拍干殘留液滴；每孔加入100 μ 1 TMB，室溫 (20±5°C )避光放置3min海孔加入100 μ 1 2Ν H2SO4終止液終止底物反應，酶標儀450nm 處讀取0D值。分析抗體阻斷PD1與PDL1相互作用的活性。
[0110] 結果顯示，SG001抗體和BMS01陽性抗體都能夠阻斷hPDLl與hPDl-FC結合， 并呈劑量依賴性；SG001抗體半數抑制劑量為1. 47 ± 0. 227 μ g/mU顯著優于陽性抗體 BMS01 (10. 62 + 0. 536 μ g/mL)，P<0. 0001。結果如圖 6 所示。
[0111] 實施例7抗體阻斷PD1與PDL2相互作用
[0112] 將PDL2蛋白（北京義翅神州生物技術有限公司）稀釋于包被緩沖液中，濃度為 1 μ g/mL，W 100 μ 1/孔的量加入到ELISA板各個孔中，4°C包被過夜。洗涂液重復洗板3遍 后，每孔加入200 μ1 1.5%酪蛋白，37°C封閉比。用PBS緩沖液稀釋hPDl-FC-Biotin(生 物素 Biotin標記的hPDl-FC蛋白，其中hPDl-FC由實施例1獲得，委托嘉喧生物完成標記） 至10 μ g/血，W該溶液稀釋待測抗體SG001、BMS01。SG001和BMS01最高濃度為100 μ g/ mU倍比稀釋，共設立12個濃度；將該梯度稀釋的抗體溶液加入封閉后的化ISA反應孔中， 每孔100 μ 1，每個樣品濃度設2個平行復孔，蓋好封板膜，37Γ水平放置1. 5小時。洗涂液 重復洗板3遍后，加入HRP標記的親和素，室溫（20 ± 5°C )避光放置45分鐘。洗涂液重復 洗板5遍，在吸水紙上盡量拍干殘留液滴；每孔加入100 μ 1 TMB，室溫（20 +5°C )避光放置 3min ;每孔加入100 μ 1 2N H2SO4終止液終止底物反應，酶標儀450nm處讀取0D值。分析抗 體阻斷PD1與PDL2相互作用的活性。
[0113] 結果顯示，SG001抗體和BMS01陽性抗體都能夠阻斷hPDl-FC-Biotin與PDL2相互 作用，并呈劑量依賴性；SG001抗體和BMS01陽性抗體之間無顯著差別。結果如圖7所示。
[0114] 實施例8抗體識別猴PD1抗原
[0115] 將猴PD1 (義翅神州）、hPDl-Fc分別包被化ISA板條，lug/ml，4°C過夜；PBST洗涂 后，加入1. 5%的酪蛋白，4°C封閉過夜；加入不同濃度的SG001抗體或者BMS01抗體，37°C 反應2小時；PBST洗涂后，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗人F油二抗（GAH-F油-HRP)，室 溫反應45分鐘；PBST重復洗板5遍，在吸水紙上盡量拍干殘留液滴；每孔加入100 μ 1 TMB， 室溫（20±5°C )避光放置3min ;每孔加入100 μ 1 2Ν H2SO4終止液終止底物反應，酶標儀 450nm處讀取0D值，分析抗體與猴PD1結合能力。
[0116] SG001抗體（圖8A)或者BMS01陽性抗體（圖8B)均能特異性識別猴PD1蛋白，呈 顯著的劑量依賴性；抗體識別猴PD1蛋白活性與識別猴PD1蛋白活性沒有顯著差別。
[0117] 實施例9抗體體外增強免疫應答
[0118] 取健康人外周血，用淋己細胞分離液（天津市漫貞洋生物制品科技有限責任公司） 分離外周血單個核細胞（PBMC)，進一步采單核細胞分離試劑盒（Miltenyi公司）從PBMC 中分離單核細胞；調整細胞濃度，按2X 10^孔接種96孔細胞培養板，培養體系為1640培 養基，含10%胎牛血清、25叫/111161-5〔尸度1〇1^6邑611(1公司）和50叫/1111比-4度1〇1^6邑611(1 公司）；37°C，5% 0)2,常規培養；每3天更換一次新鮮培養基，培養7天，誘導樹突狀細胞 值C)。
[0119] 實驗第7天，取另外一份健康人血，分離PBMC ;進一步使用CD4陽性T細胞（CD4+T) 分選試劑盒（eBioscience)從分離的PBMC中分離出CD4+T細胞；調整細胞濃度，按2X 10^ 孔接種前述誘導DC細胞的培養板中。分別加入SG001抗體和BMS01陽性抗體，濃度梯度為 0.016、0.08、0.4、2、10、50μg/ml，設置3個復孔；實驗中設置陰性組（只有CD4叮、DCW及 CD4叮聯合DC)。
[0120] 37°C，5% C〇2,常規培養5天后收獲上清，測定上清中IFN-丫表達水平。
[0121] 結果顯示（圖9)，單純CD4+T細胞、DC細胞W及CD4叮聯合DC細胞的培養上清中， IFN-丫表達呈本底水平；在加入不同濃度梯度抗體后，IFN-丫表達顯著增加，且具有劑量 依賴性；SG001抗體和BMS01陽性抗體之間沒有顯著差別。
[0122] 實施例10抗體體內增強免疫應答
[0123] 取健康人外周血，用淋己細胞分離液（天津市漫貞洋生物制品科技有限責任公司） 分離外周血單個核細胞（PBMC);用1640培養基（不含血清）將PBMC濃度調成為5X106/ ml，尾靜脈注射NPG小鼠（免疫缺陷型小鼠，維通達公司產品），每只200 μ 1，建立人PMBC 移植小鼠的移植物抗宿主排斥（GVHD)模型；實驗設置Ξ組，分別給予SGOOl抗體、BMSOl陽 性抗體和生理鹽水，抗體給藥劑量為150 μ g/只，一周給藥2次，給藥2周；分析抗PD1抗體 在體內增強免疫反應的生物學功能；每五天測量一次體重，記錄小鼠的存活時間并計算生 存率。
[0124] PMBC移植小鼠體重早期逐漸上升，到20天后體重開始下降，小鼠產生了 GV皿反 應，隨后小鼠開始出現死亡（圖10)。生理鹽水對照組中位生存時間為41天，SG001抗體、 BMS01陽性抗體組的中位生存時間分別為36天和39天，小鼠存活率降低（SG001 VS NC，P =0. 0044 ;BMS01 VS NC, P = 0. 5240)，生存時間縮短，提示GV皿效應加劇；相比BMS01陽性 抗體組，SG001抗體組小鼠平均生存時間更短，提示GV皿效應更為顯著（SG001 VS BMS01， P = 0. 0827)。實驗結果提示，SG001抗體W及BMS01陽性抗體均可W增強體內免疫反應， SG001抗體活性略優于BMS01陽性抗體。
【主權項】
1. 一種分離的抗人程序性死亡受體-1 (Human Program Death IReceptor，hPD_l)抗 體或其抗原結合片段，其重鏈可變區⑶R1序列如SEQ ID NO: 1所示，⑶R2序列如SEQ ID N0:2所示，CDR3序列如SEQIDN0:3所示；和/或輕鏈可變區的CDR1序列如SEQIDN0 :4 所示、CDR2序列如SEQ ID NO :5所示，CDR3序列如SEQ ID NO :6所示，或者所述重鏈或輕鏈 的⑶R序列與SEQ ID NO : 1-6所示序列具有至少70 %的同源性且保留相應母體序列生物 活性的變體序列，或所述重鏈或輕鏈的CDR序列為SEQ ID NO :1-6所示序列經刪除、替換和 /或添加一個或多個氨基酸殘基后獲得的保留相應母體序列生物活性的變體序列。2. 如權利要求1所述的抗hPD-Ι抗體或其抗原結合片段，其包含上述重鏈⑶R1、⑶R2 和 CDR3 和輕鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3。3. 如權利要求1或2所述的抗hPD-Ι抗體或其抗原結合片段，其重鏈可變區序列如SEQ ID NO: 7所示；和/或輕鏈可變區序列如SEQ ID NO:8所示，或者是與SEQ ID NO :7-8所示 序列具有至少70%的同源性且保留相應母體序列生物活性的變體序列，或是SEQ ID NO: 7-8所示序列經刪除、替換和/或添加一個或多個氨基酸殘基后獲得的保留相應母體序列 生物活性的變體序列。4. 如權利要求1-3任一項所述的抗hPD-Ι抗體或其抗原結合片段，其重鏈氨基酸序列 如SEQ ID NO: 13所示；和/或輕鏈氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示，或者是與SEQ ID NO: 13或11所示序列具有至少70%的同源性且保留相應母體序列生物活性的變體序列，或是 SEQ ID NO :13或11所示序列經刪除、替換和/或添加一個或多個氨基酸殘基后獲得的保 留相應母體序列生物活性的變體序列。5. 如權利要求1-4任一項所述的抗hPD-Ι抗體或其抗原結合片段，其為全長抗體，優選 地，其為IgGl或者IgG4同種型的全長抗體。6. 如權利要求1-5任一項所述的抗hPD-Ι抗體或其抗原結合片段，其為抗原結合片段， 優選地，其為Fab片段、Fab' 2片段或單鏈抗體。7. -種組合物，其包含權利要求1-6任一項所述的抗hPD-Ι抗體或其抗原結合片段。8. -種核酸分子，其編碼權利要求權利要求1-6任一項所述的抗hPD-Ι抗體或其抗原 結合片段。9. 如權利要求8所述的核酸分子，其序列如SEQ ID NO :9或10所示，或者是與SEQ ID NO :9或10具有至少70 %同源性且仍編碼具有本發明的抗體或其抗原結合片段的活性的變 體分子，或是與序列如SEQ ID NO :9或10所示的核酸分子完全互補或在中度至高度嚴格條 件下雜交的核酸分子。10. 如權利要求8或9所述的核酸分子，其序列如SEQ ID NO : 12或14所示，或者是與 SEQ ID NO :12或14具有至少70%同源性且仍編碼具有本發明的抗體或其抗原結合片段的 活性的變體分子，或是與序列如SEQ ID NO : 12或14所示的核酸分子完全互補或在中度至 高度嚴格條件下雜交的核酸分子。11. 一種表達載體，其包含權利要求8-10任一項所述的核酸分子。12. -種宿主細胞，其包含權利要求11所述的表達載體。13. -種生產權利要求1-6任一項所述的抗體或其抗原結合片段的方法，其包括步驟： 將權利要求12所述的宿主細胞在適合所述抗hPD-Ι抗體或其抗原結合片段表達的培養條 件下表達，任選地，將表達的抗體或其抗原結合片段進行純化。14.權利要求1-6任一項所述的抗體或其抗原結合片段在制備用于調控哺乳動物包括 人的免疫應答的試劑中的用途。
【專利摘要】本發明涉及抗人程序性死亡受體1抗體及其制備方法和用途。具體而言，本發明涉及利用天然抗體庫篩選平臺篩選獲得的一株新型抗人程序性死亡受體1抗體，其能夠特異性識別人PD-1分子，阻斷PD-1/PD-L1以及PD-1/PD-L2相互作用，提高免疫應答水平。
【IPC分類】A61K39/395, A61P37/04, C07K16/28, C12P21/02, C12N15/13
【公開號】CN105669864
【申請號】CN201510981105
【發明人】王立燕
【申請人】杭州尚健生物技術有限公司
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2015年12月23日