抗人程序性死亡受體1抗體及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明設及抗人程序性死亡受體1 (Human Program Death IReceptor，hPD-1)抗 體及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002] 程序性死亡受體-1 (Human Program Death 1 Rec巧tor, hPD-l)是一類重要的免 疫負性調控分子（也稱"免疫檢查點分子")，屬于CD28家族成員，該家族成員還包括CD28、 CTLA4、IC0S 和 BTLA 等。
[000引 PD-1是I型跨膜糖蛋白，由細胞外區、跨膜區和胞內區立部分構成。它的細胞膜外 部分是一個免疫球蛋白可變區（IgV)樣結構域，胞內部分N-端含有一個免疫受體酪氨酸抑 制基序（immunoreceptor tyrosine based inhibitoiT motif，KIM)，C-端含有一個免疫 受體酪氨酸轉換基序（immunoreceptor tyrosine based switch motif, ]；TSM)，其中口SM 是PD-1分子向胞內傳遞抑制信號的關鍵基序。與CTLA-4等家族成員W同源二聚體的形式 存在于T細胞表面不同，PD-1 W單體的形式表達于活化的T細胞、B細胞和髓樣細胞等細胞 表面。
[0004] PD-1 有兩個配體，即 PD-L1 度7-化，CD274)和 PD-L2 度7-DC，CD273)，屬于 B7 家 族的跨膜分子。PD-L1廣泛分布于成熟的巨隧細胞、B細胞、樹突狀細胞等造血細胞W及內 皮細胞、膜島細胞、肥大細胞等非造血細胞表面，而且在多種腫瘤細胞表面均高表達；PD-L2 只在巨隧細胞、樹突狀細胞及部分B細胞亞類等細胞表面表達。與經典的免疫負性調控分 子細胞毒T淋己細胞相關抗原4(CTLA-4)相類似，PD-1通過與其配體PDLUPDL2相互作用 發揮免疫負調控作用。當PD-1與配體相互作用時，其胞內段口SM發生憐酸化并且招募相 應的憐酸化酶SHP-1和SHP-2,導致下游信號分子去憐酸化從而下調免疫細胞應答水平。免 疫系統的運一負性調控機制是維持機體免疫耐受的關鍵分子基礎。然而，大量的研究表明， PD-1等免疫負性調控分子過度表達及其與受體PD-L1/PD-L2相互作用所誘導的機體免疫 抑制狀態在癌癥W及HIV、HCV、皿V等慢性感染性疾病發病過程中發揮重要作用。通過阻 斷PD-1/PD-L1相互作用，可W逆轉免疫抑制，提高免疫系統殺傷病毒和腫瘤細胞的能力； 同時阻斷PD-1/PD-L2相互作用，免疫抑制狀態逆轉效果更好。因此，祀向運類負性調控分 子成為新一代癌癥治療策略，PD1/PDL1通路抑制劑的研究備受關注。特異性阻斷PD1/PDL1 信號通路的抗體藥物是該領域研究的重點。抗PD1抗體納武單抗（Nivolumab，化divo,百 時美施貴寶）和化mbrolizum油化eytruda，默克）均獲得了 FDA突破性藥物資格并獲批上 市。其中百時美施貴寶產品納武單抗于2014年12月獲抑A批準上市，用于黑色素瘤臨床 治療；隨后在2015年3月，FDA批準該抗體用于治療鱗狀非小細胞肺癌，標志著該類免疫療 法正式進入實體瘤臨床治療領域。
[0005] 本領域依然存在對特異性阻斷PD1/PDL1信號通路的抗體藥物的需求。
【發明內容】
[0006] 本發明的第一方面設及一種分離的抗人程序性死亡受體-1 (Human Program Death IRec巧tor，hPD-l)抗體或其抗原結合片段，其重鏈可變區CDRl序列如SEQ ID N0:1 所示，〔032序列如569 10^:2所示，〔01?3序列如569 10^:3所示；和/或輕鏈可變區的 CDRl序列如沈Q ID N0:4所示、CDR2序列如沈Q ID N0:5所示，CDR3序列如沈Q ID N0:6 所示，或者所述重鏈或輕鏈的CDR序列與SEQ ID NO :1-6所示序列具有至少70%的同源性 且保留相應母體序列生物活性的變體序列，如至少75 %、80 %、85 %、90 %、91 %、92 %的同 源性，或所述重鏈或輕鏈的CDR序列為SEQ ID NO: 1-6所示序列經刪除、替換和/或添加一 個或多個氨基酸殘基后獲得的保留相應母體序列生物活性的變體序列，如1、2、3、4或5個 氨基酸殘基。
[0007] 在一些實施方案中，所述的抗hPD-1抗體或其抗原結合片段上述重鏈CDR1、CDR2 和 CDR3 和輕鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3。
[0008] 在一些實施方案中，所述的抗hPD-1抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區序列如 569 10^:7所示；和/或輕鏈可變區序列如569 10^:8所示，或者與569 10^:7-8 所示序列具有至少70 %的同源性且保留相應母體序列生物活性的變體序列，如至少75%、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.1%的同源性，或沈9 10側：7-8所示 序列經刪除、替換和/或添加一個或多個氨基酸殘基后獲得的保留相應母體序列生物活性 的變體序列，如1、2、3、4、5、10、15、20、30或50個氨基酸殘基。
[0009] 在一些實施方案中，所述的抗hPD-1抗體或其抗原結合片段的重鏈氨基酸序列 如SEQ ID NO: 13所示；和/或輕鏈可變區序列如SEQ ID NO: 11所示，或者與SEQ ID NO : 13或11所示序列具有至少70%的同源性且保留相應母體序列生物活性的變體序列，如至 少 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 1%、99. 2%、99. 3%、99. 4%、 99. 5%、99. 6%、99. 7%或99. 8%的同源性，或沈Q ID NO :13或11所示序列經刪除、替換 和/或添加一個或多個氨基酸殘基后獲得的保留相應母體序列生物活性的變體序列，如1、 2、3、4、5、10、15、20、30、50個或100氨基酸殘基。
[0010] 在一些實施方案中，所述的抗hPD-1抗體或其抗原結合片段為全長抗體，優選地， 其為IgGl或者IgG4同種型的全長抗體。
[0011] 在一些實施方案中，所述的抗hPD-1抗體或其抗原結合片段為抗原結合片段，優 選地，其為Fab片段、Fab' 2片段或單鏈抗體。
[0012] 本發明的第二方面設及一種組合物，其包含上述第一方面所述的抗hPD-1抗體或 其抗原結合片段。
[0013] 本發明的第Ξ方面設及一種核酸分子，其編碼上述第一方面所述的抗hPD-1抗體 或其抗原結合片段。
[0014] 在一些實施方案中，所述的核酸分子的序列如SEQ ID NO :9或10所示，或者是 與SEQ ID NO :9或10具有至少70%同源性且仍編碼具有本發明的抗體或其抗原結合片 段的活性的變體分子，如至少 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 1%、 99. 2%、99. 4%、99. 5%、99. 6%或99. 7%的同源性，或是與序列如沈Q ID N0:9或10所 示的核酸分子完全互補或在中度至高度嚴格條件下雜交的核酸分子，所述中度嚴格條件 的一個例子是包括在5XSSC、0. 5% SDSU.OmM邸TA(p冊.0)的溶液中預洗；在50-60°C、 5XSSC、過夜的條件下雜交；再于65°C下20分鐘用含0. 1% SDS的2X、0. 5X和0. 2X的 ssc各洗涂兩次，合適的高嚴格雜交條件包括上述的條件，所不同的是雜交溫度升高了，例 如達到 60-65°C或 65-70°C。
[0015] 在一些實施方案中，所述的核酸分子的序列如SEQ ID NO :12或14所示，或者是 與SEQ ID NO :12或14具有至少70%同源性且仍編碼具有本發明的抗體或其抗原結合片 段的活性的變體分子，如至少 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 1%、 99.2%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或更高的同源性，或是與序列如 SEQ ID NO :12或14所示的核酸分子完全互補或在中度至高度嚴格條件下雜交的核酸分 子，所述中度嚴格條件的一個例子是包括在5XSSC、0. 5%SDS、1.0mM邸TA(p冊.0)的溶 液中預洗；在50-60°C、5XSSC、過夜的條件下雜交；再于65°C下20分鐘用含0. 1% SDS的 2X、0. 5X和0. 2X的SSC各洗涂兩次，合適的高嚴格雜交條件包括上述的條件，所不同的 是雜交溫度升高了，例如達到60-65°C或65-70°C。
[0016] 本發明的第四方面設及一種表達載體，其上述第Ξ方面所述的核酸分子。本發明 的表達載體并無特別限定，只要其能表達本發明要求保護的抗體或其抗原結合片段即可。
[0017] 本發明的第五方面設及一種宿主細胞，其包含上述第四方面所述的表達載體。
[0018] 本發明的第六方面設及一種生產上述第一方面所述的抗體或其抗原結合片段的 方法，其包括步驟：將第五方面所述的宿主細胞在適合所述抗hPD-1抗體或其抗原結合片 段表達的培養條件下表達，任選地，將表達的抗體或其抗原結合片段進行純化。
[0019] 本發明第屯方面設及上述第一方面所述的抗體或其抗原結合片段在制備用于調 控哺乳動物包括人的免疫應答的試劑中的用途。
[0020] 換言之，本發明利用天然抗體庫篩選平臺篩選獲得一株新型抗hPD-1抗體SG001， 其能夠特異性識別人和猴的PD-1分子，阻斷PD-1/PD-L1 W及PD-1/PD-L2相互作用，調節 免疫應答，提高免疫應答水平。本發明的抗人PD-1抗體與人PD1特異性結合并表現出良好 的特性。運些特性包括與人PD-1的高親和力結合，但與CD28、CTLA4、BTLA W及IC0S等其 它CD28家族成員沒有交叉反應。
[0021] 在一些實施方案中，本發明設及抗人PD-1抗體或其抗原結合部分，其至少表現出 一項下列性質：
[002引 （1) W 1X 10 7m或更小的Kd與人PD-1結合；
[0023] (2)不顯著與 CD28、CTLA4、BTLA W及 IC0S 等結合；
[0024] (3)在MLR實驗中增加干擾素丫的表達水平；
[00幼 （4) W 1 X 10 7M或更小的Kd與猴PD-1結合；
[0026] (5)抑制 PD-L1 和 / 或 PD-L2 與 PD-1 的結合；
[0027] (6)刺激免疫應答。
[0028] 本發明的抗人PD-1抗體或其抗原結合部分的優點尤其表現在其阻斷PD1/PDL1的 活性相對于現有技術具有顯著性的提高，例如與現有技術的BMS01相比，其阻斷PD1/PDL1 的活性提高了 6倍（如實施例6和圖6所示，SG001抗體半數抑制劑量為1. 47 + 0. 227 μ g/ 血，顯著優于陽性抗體BMSOl (10. 62 + 0. 536 μ g/mL