[0039]d、將c步獲得高流分洗脫液加入4% (m/v)的活性炭脫色，溫度20°C，攪拌脫色1min，過濾獲得四氫嘧啶脫色液，透光率為99.5 %。
[0040]e、將d步獲得的脫色液減壓濃縮至原體積液的8%，加入乙醇沉淀獲得四氫嘧啶粗品O
[0041]f、將e步獲得的四氫嘧啶粗品重新溶解于去離子水至飽和，4°C下靜置結晶后過濾獲得晶體，60°C干燥后得到四氫嘧啶成品98.6g。
[0042]g、使用UltiMate 3000(Thermo Scientific)高效液相色譜儀測定四氫啼啶。取f步獲得的成品加水溶解后使用微量進樣針，進樣量20yL，色譜柱為TSK-GEL C18色譜柱，柱溫300C，流動相為2%乙腈，流速lmL/min，紫外檢測波長210nm。根據標準曲線計算四氫啼啶純度為98.0%。
[0043]實施例3:
[0044]a、取四氫嘧啶發酵液5L(四氫嘧啶含量25.(^/1)，用411101/1的鹽酸調節?!1為5.0，進入微濾膜分離系統，得到去除菌體的四氫嘧啶微濾液;所述微濾膜分離系統采用中空纖維微濾膜，微濾膜孔徑為0.12μπι，操作溫度為45°C，操作壓力為0.1MPa。收集過濾液，當過濾液中四氫嘧啶濃度低于1.0g/L時停止收集，菌體去除率為94.6%。
[0045]b、將經a步得到的微濾液栗入超濾膜分離系統，得到去除蛋白和色素的四氫嘧啶超濾液。所述超濾膜分離系統采用中空纖維超濾膜，超濾膜孔徑為0.006μπι，操作溫度為250C，操作壓力為0.2MPa，收集過濾液，當過濾液中四氫嘧啶濃度低于1.0g/L時停止收集，蛋白去除率為77.6%,透光率為69.8%。
[0046]C、將b步獲得的超濾液以lBV/h的流速栗入D072陽離子交換樹脂吸附，吸附飽和后用0.lmol/L的氨水洗脫，洗脫流速為1.5BV/h，收集pH為7-12的四氫嘧啶高流分洗脫液。
[0047]d、將c步獲得高流分洗脫液加入2% (m/v)的活性炭脫色，溫度35°C，攪拌脫色30min，過濾獲得四氫嘧啶脫色液，透光率為99.3 %。
[0048]e、將d步獲得的脫色液減壓濃縮至原體積液的15%，加入乙醇沉淀獲得四氫嘧啶粗品。
[0049]f、將e步獲得的四氫嘧啶粗品重新溶解于去離子水至飽和，4°C下靜置結晶后過濾獲得晶體，60°C干燥后得到四氫嘧啶成品96.0g。
[0050]g、使用UltiMate 3000(Thermo Scientific)高效液相色譜儀測定四氫啼啶。取f步獲得的成品加水溶解后使用微量進樣針，進樣量20yL，色譜柱為TSK-GEL C18色譜柱，柱溫300C，流動相為2%乙腈，流速lmL/min，紫外檢測波長210nm。根據標準曲線計算四氫啼啶純度為96.6%。
[0051 ] 實施例4:
[0052]a、取四氫嘧啶發酵液5L(四氫嘧啶含量25.(^/1)，用411101/1的鹽酸調節?!1為3.0，進入微濾膜分離系統，得到去除菌體的四氫嘧啶微濾液;所述微濾膜分離系統采用中空纖維微濾膜，微濾膜孔徑為0.2μπι，操作溫度為25°C，操作壓力為0.05MPa。收集過濾液，當過濾液中四氫嘧啶濃度低于1.0g/L時停止收集，菌體去除率為92.0%。
[0053]b、將經a步得到的微濾液栗入超濾膜分離系統，得到去除蛋白和色素的四氫嘧啶超濾液。所述超濾膜分離系統采用中空纖維超濾膜，超濾膜孔徑為0.ΟΟΙμπι，操作溫度為450C，操作壓力0.5MPa，收集過濾液，當過濾液中四氫嘧啶濃度低于1.0g/L時停止收集，蛋白去除率為82.4%，透光率為75.6%。
[0054]C、將b步獲得的超濾液以lBV/h的流速栗入D061陽離子交換樹脂吸附，吸附飽和后用0.02mol/L的氨水洗脫，洗脫流速為lBV/h，收集pH為7_12的四氫嘧啶高流分洗脫液。
[0055]d、將c步獲得高流分洗脫液加入0.05% (m/v)的活性炭脫色，溫度30°C，攪拌脫色20min，過濾獲得四氫嘧啶脫色液，透光率為98.8 %。
[0056]e、將d步獲得的脫色液減壓濃縮至原體積液的5%，加入乙醇沉淀獲得四氫嘧啶粗品O
[0057]f、將e步獲得的四氫嘧啶粗品重新溶解于去離子水至飽和，4°C下靜置結晶后過濾獲得晶體，60°C干燥后得到四氫嘧啶成品96.8g。
[0058]g、使用UltiMate 3000(Thermo Scientific)高效液相色譜儀測定四氫啼啶。取f步獲得的成品加水溶解后使用微量進樣針，進樣量20yL，色譜柱為TSK-GEL C18色譜柱，柱溫300C，流動相為2%乙腈，流速lmL/min，紫外檢測波長210nm。根據標準曲線計算四氫啼啶純度為97.5%。
【主權項】
1.一種從發酵液中分離提取四氫嘧啶的方法，包括如下步驟: a、取富含四氫嘧啶的發酵液，用鹽酸調節pH為3.0-6.0后栗入微濾膜分離系統，收集過濾液，當過濾液中四氫嘧啶濃度低于1.0g/L時停止收集，得到除去菌體的四氫嘧啶微濾液； b、將a步獲得的微濾液栗入超濾膜分離系統，對微濾液進行除蛋白和脫色處理，收集過濾液，當過濾液中四氫嘧啶濃度低于1.0g/L時停止收集，得到除去蛋白和色素的四氫嘧啶超濾液； c、將b步獲得的超濾液栗入離子交換柱，經陽離子交換樹脂吸附，進樣流速為lBV/h，吸附飽和后采用0.02-0.2mol/L的氨水洗脫，洗脫流速為0.05_2BV/h，收集pH=7_12的四氫嘧啶高流分洗脫液； d、將c步獲得的高流分洗脫液加入0.05%~5%(m/v)的活性炭脫色，溫度20-40V，攪拌脫色10-30min，過濾獲得四氫嘧啶脫色液； e、將d步獲得的脫色液減壓濃縮至原體積的5%-15%，加入乙醇沉淀獲得四氫嘧啶粗品; f、將e步獲得的四氫嘧啶粗品重新溶解于去離子水至飽和，4°C下靜置結晶后過濾獲得晶體，60°C干燥后得到四氫嘧啶成品。2.如權利要求1所述的一種從發酵液中分離提取四氫嘧啶的方法，其特征在于，步驟a中所述的微濾膜分離系統采用中空纖維微濾膜，微濾膜孔徑為0.02-0.2μπι，操作溫度為25-.45°C，操作壓力為0.05-0.2MPa。3.如權利要求1所述的一種從發酵液中分離提取四氫嘧啶的方法，其特征在于，步驟b中所述的超濾膜分離系統采用中空纖維超濾膜，超濾膜孔徑為0.001-0.Ο?μπι，操作溫度為.25-45°C，操作壓力為0.1-0.5MPa。4.如權利要求1所述的一種從發酵液中分離提取四氫嘧啶的方法，其特征在于，步驟c中所述的陽離子交換樹脂為凝膠型樹脂或大孔型樹脂。5.如權利要求1或4所述的一種從發酵液中分離提取四氫嘧啶的方法，其特征在于，步驟c中所述的陽離子交換樹脂為001*7，D072，D061樹脂中的一種。6.如權利要求1所述的一種從發酵液中分離提取四氫嘧啶的方法，其特征在于，還包括對步驟f得到的四氫嘧啶成品純度的檢測，使用UltiMate 3000 Thermo Scientif ic高效液相色譜儀測定四氫嘧啶，色譜柱為TSK-GEL C18色譜柱，柱溫30°C，流動相為2%乙腈，流速lmL/min，紫外檢測波長210nm。7.如權利要求1所述的一種從發酵液中分離提取四氫嘧啶的方法，包括如下步驟: a、取四氫嘧啶發酵液5L，四氫嘧啶含量25.(^/1，用411101/1的鹽酸調節?!1為4.0，進入微濾膜分離系統，得到去除菌體的四氫嘧啶微濾液;所述微濾膜分離系統采用中空纖維微濾膜，微濾膜孔徑為0.02μπι，操作溫度為30°C，操作壓力為0.2MPa，收集過濾液，當過濾液中四氫嘧啶濃度低于1.0g/L時停止收集;菌體去除率為99.2%； b、將經a步得到的微濾液栗入超濾膜分離系統，得到去除蛋白和色素的四氫嘧啶超濾液;所述超濾膜分離系統采用中空纖維超濾膜，超濾膜孔徑為0.003ym，操作溫度為40 V，操作壓力為0.3MPa，收集過濾液，當過濾液中四氫嘧啶濃度低于1.0g/L時停止收集，蛋白去除率為80.8%，透光率為72.3% ； c、將b步獲得的超濾液以lBV/h的流速栗入D061陽離子交換樹脂吸附，吸附飽和后用.0.15mol/L的氨水洗脫，洗脫流速為0.05BV/h，收集pH為7_12的四氫嘧啶高流分洗脫液； d、將c步獲得高流分洗脫液加入3%(m/v)的活性炭脫色，溫度40°C，攪拌脫色15min，過濾獲得四氫嘧啶脫色液，透光率為99.8% ; e、將d步獲得的脫色液減壓濃縮至原體積液的10%，加入乙醇沉淀獲得四氫嘧啶粗品； f、將e步獲得的四氫嘧啶粗品重新溶解于去離子水至飽和，4°C下靜置結晶后過濾獲得晶體，60 0C干燥后得到四氫嘧啶成品101.3g; g、使用UltiMate3000(Thermo Scientific)高效液相色譜儀測定四氫啼啶，取f步獲得的成品加水溶解后使用微量進樣針，進樣量20yL，色譜柱為TSK-GEL C18色譜柱，柱溫30°C，流動相為2%乙腈，流速lmL/min，紫外檢測波長210nm，根據標準曲線計算四氫啼啶純度為 98.2%。
【專利摘要】本發明提供一種從發酵液中分離提取四氫嘧啶的方法，克服現有生產工藝中存在的工藝路線復雜，分離純化困難，能耗水耗較多等問題。本發明從富含四氫嘧啶的發酵液中分離提取四氫嘧啶，首先利用雙膜系統即微濾膜、超濾膜分離系統過濾去除發酵液中的菌體、大部分蛋白和部分色素，然后利用陽離子交換樹脂吸附四氫嘧啶，再用氨水將四氫嘧啶洗脫后，經過活性炭脫色、濃縮醇沉、重結晶、干燥成品等操作步驟得到四氫嘧啶晶體。
【IPC分類】C07D239/06
【公開號】CN105669560
【申請號】CN201610017537
【發明人】陳寧, 范曉光, 寧義科, 徐慶陽, 謝希賢, 張成林, 李燕軍
【申請人】天津科技大學
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年1月12日