一種從發酵液中分離提取四氫嘧啶的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種從發酵液中分離提取四氫嘧啶的方法，屬于發酵法生產氨基酸衍生物的技術領域。
【背景技術】
[0002]四氫嘧啶(Ectoine)，又叫1，4，5，6_四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸，英文學名為1，4，5，6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylic acid。它是一種環狀氨基酸衍生物，相對分子量142.16,分子式為C6H1QN2O2，其分子結構上具有的一個氨基和一個羧基使其具有氨基酸的兩性性質。四氫嘧啶是微生物細胞的能源物質、滲透壓調節物質和細胞及大分子物質的生物保護劑，可以緩解高滲、高溫、凍融、干燥、輻射和化學試劑對蛋白、核酸、生物膜及整個細胞的毒害作用。由于四氫嘧啶是所有已知的相溶性溶質中對生物細胞及大分子物質保護效果最好的，所以近年來它在化妝品、酶工業及生物醫藥等領域的應用也日益受到關注。
[0003]四氫嘧啶的生產方法有提取法、化學合成法、酶催化法和發酵法。提取法和化學合成法由于原料來源受限制，分離純化困難，收率低，產品純度低，污染環境嚴重，大量生產成本高，難以實現工業化生產。而發酵法生產具有原料成本低、反應條件溫和、易于實現大規模生產等優點。
[0004]現有技術是從嗜鹽菌細胞中提取四氫嘧啶。專利申請201410754792.1提供了一種四氫嘧啶的提取工藝，主要包括預處理、四氫嘧啶溶出、活性炭脫色、電滲析脫鹽、濃縮、離子交換、濃縮、冷凍結晶等步驟。該方法預處理涉及離心收集菌體、干燥、粉碎、加水使四氫嘧啶溶出等步驟，工藝繁瑣復雜，離心、粉碎能耗高。同時由于嗜鹽菌培養中使用較高濃度的NaCl，因此在提取四氫嘧啶過程中需要電滲析和陽陰離子交換樹脂兩步脫鹽工藝，含酸堿廢水的排放量大。專利申請201110097221.1提供了四氫嘧啶及羥基四氫嘧啶的膜技術提取方法，該方法需使用水低滲沖擊釋放四氫嘧啶，并使用芳香族聚酰胺復合膜脫鹽，膜分離成本高，提取收率低。最近的研究中一種新型基因工程大腸桿菌的使用可以使四氫嘧啶大量積累到發酵液中(申請號201510410080.2)，該基因工程大腸桿菌可以將四氫嘧啶分泌到發酵液中且培養基中無需添加高濃度的NaCl。因此，本發明提供了一種從富含四氫嘧啶的發酵液中提取四氫嘧啶的工藝，與從嗜鹽菌細胞中提取四氫嘧啶的工藝相比，本工藝簡單易行、分離效率高、分離成本低、極具工業化價值。
【發明內容】
[0005]本發明目的是提供一種新型的四氫嘧啶的分離提取工藝，克服現有生產工藝中存在的工藝路線復雜，分離純化困難，能耗水耗較多等問題。
[0006]本發明為了實現上述目的而采取的技術方案概述如下:
[0007]本發明從富含四氫嘧啶的發酵液中分離提取四氫嘧啶，首先利用雙膜系統即微濾膜、超濾膜分離系統過濾去除發酵液中的菌體、大部分蛋白和部分色素，然后利用陽離子交換樹脂吸附四氫嘧啶，再用氨水將四氫嘧啶洗脫后，經過活性炭脫色、濃縮醇沉、重結晶、干燥成品等操作步驟得到四氫嘧啶晶體。
[0008]本發明技術方案具體包括如下步驟:
[0009]a、取富含四氫嘧啶的發酵液，用鹽酸調節pH為3.0-6.0后栗入微濾膜分離系統，收集過濾液，當過濾液中四氫嘧啶濃度低于1.0g/L時停止收集，得到除去菌體的四氫嘧啶微濾液；
[0010]b、將a步獲得的微濾液栗入超濾膜分離系統，對微濾液進行除蛋白和脫色處理，收集過濾液，當過濾液中四氫嘧啶濃度低于1.0g/L時停止收集，得到除去蛋白和色素的四氫嘧啶超濾液；
[0011]c、將b步獲得的超濾液栗入離子交換柱，經陽離子交換樹脂吸附，進樣流速為IBV/h，吸附飽和后采用0.02-0.2mol/L的氨水洗脫，洗脫流速為0.05_2BV/h，收集pH=7_12的四氫嘧啶高流分洗脫液；
[0012]d、將c步獲得的高流分洗脫液加入0.05%-5%(m/v)的活性炭脫色，溫度20-40V，攪拌脫色10-30min，過濾獲得四氫嘧啶脫色液；
[0013]e、將d步獲得的脫色液減壓濃縮至原體積的5%_15%，加入乙醇沉淀獲得四氫嘧口定粗品；
[0014]f、將e步獲得的四氫嘧啶粗品重新溶解于去離子水至飽和，4°C下靜置結晶后過濾獲得晶體，60°C干燥后得到四氫嘧啶成品。
[0015]進一步地，上述步驟a中的微濾膜分離系統采用中空纖維微濾膜，微濾膜孔徑為
0.02-0.2μπι，操作溫度為25-45°C，操作壓力為0.05-0.2MPa。
[0016]進一步地，上述步驟b中的超濾膜分離系統采用中空纖維超濾膜，超濾膜孔徑為
0.001-0.Ο?μπι，操作溫度為25-45°C，操作壓力為0.1-0.5MPa。
[0017]進一步地，上述步驟c中的陽離子交換樹脂可以是凝膠型樹脂，也可以是大孔型樹脂。
[0018]更進一步地，上述步驟C中的陽離子交換樹脂具體可以為001*7，D072，D061樹脂中的一種，優選D061。
[0019]進一步地，本發明還提供一種檢測上述四氫嘧啶成品純度的方法，使用UltiMate3000(Thermo Scientific)高效液相色譜儀測定四氫嘧啶，色譜柱為TSK-GEL C18色譜柱，柱溫30°C，流動相為2%乙腈，流速lmL/min，紫外檢測波長210nm。
[0020]有益效果:
[0021]與現有工藝相比，本發明的方法具有以下優點:
[0022]I)本發明采用雙膜系統去除發酵液中的菌體、大部分蛋白和色素，與離心收集菌體相比，能耗較低，菌體和蛋白質的截留率較高。
[0023]2)本發明根據四氫嘧啶兩性電解質的特點利用陽離子交換樹脂對四氫嘧啶吸附，能有效除去發酵液中無機鹽陰離子、乙酸等雜質。同時由于無機鹽陽離子與陽離子樹脂的結合能力較強，在使用氨水洗脫的時候可以通過控制氨水濃度和洗脫流速，選擇性的將四氫嘧啶優先洗脫下來，洗脫液中的銨根離子則可以在減壓濃縮過程中揮發出去，從而有效實現了四氫嘧啶的分離，避免了電滲析、陽陰離子交換樹脂或納濾脫鹽等復雜操作。
[0024]3)本發明根據四氫嘧啶易溶于水微溶于乙醇的特點，通過乙醇沉淀和重結晶的方法進彳丁精制，有效提尚了廣品的回收率和純度。
【附圖說明】
[0025]圖1:本發明四氫嘧啶的提取工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0026]下面通過具體的實施方案敘述本發明。除非特別說明，本發明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發明的范圍，本發明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本發明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發明的保護范圍。
[0027]實施例1:
[0028]a、取四氫嘧啶發酵液5L(四氫嘧啶含量25.0g/L)，用4mol/L的鹽酸調節pH為4.0，進入微濾膜分離系統，得到去除菌體的四氫嘧啶微濾液;所述微濾膜分離系統采用中空纖維微濾膜，微濾膜孔徑為0.02μπι，操作溫度為30°C，操作壓力為0.2MPa。收集過濾液，當過濾液中四氫嘧啶濃度低于1.0g/L時停止收集，菌體去除率為99.2%。
[0029]b、將經a步得到的微濾液栗入超濾膜分離系統，得到去除蛋白和色素的四氫嘧啶超濾液。所述超濾膜分離系統采用中空纖維超濾膜，超濾膜孔徑為0.003μπι，操作溫度為400C，操作壓力為0.3MPa，收集過濾液，當過濾液中四氫嘧啶濃度低于1.0g/L時停止收集，蛋白去除率為80.8%,透光率為72.3 %。
[0030]C、將b步獲得的超濾液以lBV/h的流速栗入D061陽離子交換樹脂吸附，吸附飽和后用0.15mol/L的氨水洗脫，洗脫流速為0.05BV/h，收集pH為7_12的四氫嘧啶高流分洗脫液。
[0031]d、將c步獲得高流分洗脫液加入3% (m/v)的活性炭脫色，溫度40°C，攪拌脫色15min，過濾獲得四氫嘧啶脫色液，透光率為99.8 %。
[0032]e、將d步獲得的脫色液減壓濃縮至原體積液的10%，加入乙醇沉淀獲得四氫嘧啶粗品。
[0033]f、將e步獲得的四氫嘧啶粗品重新溶解于去離子水至飽和，4°C下靜置結晶后過濾獲得晶體，60 °C干燥后得到四氫嘧啶成品101.3g。
[0034]g、使用UltiMate 3000(Thermo Scientific)高效液相色譜儀測定四氫啼啶。取f步獲得的成品加水溶解后使用微量進樣針，進樣量20yL，色譜柱為TSK-GEL C18色譜柱，柱溫300C，流動相為2%乙腈，流速lmL/min，紫外檢測波長210nm。根據標準曲線計算四氫啼啶純度為98.2%。
[0035]實施例2:
[0036]a、取四氫嘧啶發酵液5L(四氫嘧啶含量25.0g/L)，用4mol/L的鹽酸調節pH為6.0，進入微濾膜分離系統，得到去除菌體的四氫嘧啶微濾液;所述微濾膜分離系統采用中空纖維微濾膜，微濾膜孔徑為0.05μπι，操作溫度為35°C，操作壓力為0.15MPa。收集過濾液，當過濾液中四氫嘧啶濃度低于I.0g/L時停止收集，菌體去除率為97.4%。
[0037]b、將經a步得到的微濾液栗入超濾膜分離系統，得到去除蛋白和色素的四氫嘧啶超濾液。所述超濾膜分離系統采用中空纖維超濾膜，超濾膜孔徑為Ο.ΟΙμπι，操作溫度為35°C，操作壓力為0.1MPa，收集過濾液，當過濾液中四氫嘧啶濃度低于1.0g/L時停止收集，蛋白去除率為74.1%,透光率為66.5%。
[0038]C、將b步獲得的超濾液以lBV/h的流速栗入001*7陽離子交換樹脂吸附，吸附飽和后用0.2mol/L的氨水洗脫，洗脫流速為2BV/h，收集pH為7-12的四氫嘧啶高流分洗脫液。