用，術語"載體"包括質粒、表達載體、克隆載體、病毒載體等。可選用本 領域已知的各種載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發明新納米抗體的核苷酸序列 可操作地連于表達調控序列，可以形成表達載體。
[0077] 在本發明中，術語"宿主細胞"包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的 例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。用于表達納米抗體的宿主細胞包括大腸桿菌、酵母細胞、 昆蟲細胞、C0S細胞、CH0細胞等。較佳地，該宿主細胞是原核細胞，更佳地是大腸桿菌細胞。
[0078] 在獲得轉化的宿主細胞后，可在適合表達本發明納米抗體的條件下培養該細胞， 從而表達出納米抗體；然后再分離出表達的納米抗體。
[0079] 試劑盒
[0080] 基于本發明獲得的新的納米抗體，本發明提供一種檢測重金屬Cd的試劑盒，所述 的試劑盒可用于重金屬Cd的檢測。所述的試劑盒含有：本發明所述的納米抗體或納米抗體 噬菌體（噬菌粒）。
[0081] 作為一種實施方式，可以將待測樣品包被于固相載體上，以本發明的納米抗體作 為檢測抗體進行檢測，所述的納米抗體可連接一可檢測標記物，或可以與連接可檢測標記 物的另一抗體（抗抗體）結合，從而獲知待測樣品中重金屬Cd的存在情況。應理解，在獲 得了本發明的納米抗體后，可以采取多種本領域已知的方式來實施重金屬Cd的檢測，這些 方式均包含在本發明中。
[0082] 在確定了本發明的試劑盒所采用的檢測抗體后，可以采用本領域常規可用于與檢 測抗體結合來進行檢測的各種標記物作為可檢測標記物。本發明對所采用的標記物沒有特 別的限制，只要是能夠與所述的檢測抗體結合，且在適當處理后能夠準確地指示待檢測樣 品中重金屬Cd的存在與否以及存在量的標記物均是可用的。例如，所述的標記物可以選自 (但不限于）：辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β -D-半乳糖苷酶、脲酶、過 氧化氫酶、或葡萄糖淀粉酶。例如，所述的檢測抗體采用辣根過氧化物酶（HRP)標記。抗體 標記的方法在本領域是公知的，例如用簡易過碘酸鈉法或者戊二醛二步法進行HRP標記抗 體。
[0083] 當采用如上所示的一些酶標記物時，還需要采用一些與相應的酶結合的底物，從 而可通過顯色等方式來報導標記物的存在情況或者存在量。所述的底物例如（但不限于）： 用于辣根過氧化物酶的鄰苯二胺（0PD)、四甲基聯苯胺（ΤΜΒ)、ABTS ;用于堿性磷酸酯酶的 對硝基苯憐酸酯（P_nitrophenyl phosphate，ρ-ΝΡΡ)。
[0084] 為了消除假陽性和假陰性，宜在檢測過程中設置質控（對照）。所述的質控品例如 采用重金屬Cd標準品。此外，為了獲得定量結果，可以在檢測過程中設置含已知濃度的多 個重金屬Cd的標準品。對于標準品的設置方法可采用常規的方法。利用所述的標準品，標 準曲線如下設置：用標準品的0D值檢測結果為縱坐標（Y軸），標準品濃度為橫坐標（X軸） 繪制成重金屬Cd試劑盒的定量標準曲線。從而，根據待測樣品檢測獲得的0D值，利用標準 曲線可計算出待測樣品中重金屬Cd的濃度。
[0085] 此外，為了使本發明的試劑盒在檢測時更方便，所述的試劑盒中優選的還包含其 它一些輔助試劑，所述的輔助試劑是酶聯免疫試驗中常規使用的一些試劑，這些試劑的特 性以及它們的配制方法均是本領域技術人員所熟知的。所述的試劑例如（但不限于）：顯 色劑、洗滌液、終止液，增敏稀釋液。
[0086] 所述的包被抗體被包被在固相載體上。本發明對所采用的固相載體沒有特別的限 制，只要其能夠與包被抗體相偶聯（連接）即可。例如，所述的固相載體選自：微量滴定板 (又稱為多孔板，如96孔板）或微球。
[0087] 在本發明的一個實例中，采用的固相載體是微量滴定板（酶標板），所述的微量滴 定板是一種聚苯乙烯板，規格是12X8可拆卸條板。
[0088] 由于本發明的試劑盒采用的納米抗體配合單克隆抗體對于重金屬Cd具有極其優 異的結合特性（高特異性）。按照上述方法，只要設置已知濃度的抗原對照，制作濃度標準 曲線，通過比照濃度標準曲線就可以得出待測樣品中的重金屬Cd含量。
[0089] 本發明首次獲得一種對于重金屬Cd特異性良好的納米抗體，能夠快速檢驗重金 屬Cd，檢測過程方便快捷成本低，且抗體擴增穩定性強。本發明為有效檢測重金屬Cd提供 了一種優異的試劑。
[0090] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
[0091] 本發明的實施例中進行的研究工作的整體流程步驟參照圖1。
[0092] 實施例1、重金屬完全抗原的制備及鑒定
[0093] 1、完全抗原的制備
[0094] 本發明人所用的噬菌體抗體庫展示技術是固相純化抗原篩選的一種篩選方法， 重金屬離子本身分子量很小不具有免疫原性無法對其進行固相化，且其本身帶有電荷，會 與分子發生強烈的不可逆反應，所以與載體蛋白（BSA、0VA)偶聯形成完全抗原再進行篩 選。這里本發明人利用一種雙功能螯合劑P-SCN-Bn-DTPA(簡稱DTPA)--既能與金屬離 子螯合又能與載體蛋白偶聯，從而得到完全抗原Cd-DTPA-BSA、Cd-DTPA-〇VA及無金屬抗原 DTPA-BSA、DTPA-0VA。
[0095] 重金屬離子與螯合劑的螯合：
[0096] 取一定量的DTPA溶液（10mg/ml)于無菌的1. 5ml EP管中，用0. 1M PH7. 4的HEPES 緩沖液稀釋，然后以Cd2+與DTPA摩爾比為4:1的比例逐滴緩慢地加入Cd2+溶液，邊加邊緩 慢振蕩，調PH 7. 0后用封口膜將管口封好，然后將上混合液轉移至旋轉培養器上，25°C下 螯合反應16h。
[0097] 螯合物Cd-DTPA與載體蛋白的偶聯：
[0098] 取一定量的載體蛋白溶液BSA和0VA，使得蛋白與螯合劑的摩爾比為30:1，于一新 的1. 5ml EP管中（0. 1M PH9. 0HEPES緩沖液稀釋），然后將螯合好的螯合物取出，緩慢的加 入到蛋白稀釋液中，邊加邊緩慢混勻，調PH至PH 9. 0后用封口膜將管口封好，然后于旋轉 培養器上，25°C下偶聯反應24h。同時，制備一批無金屬抗原，即DTPA-BSA/0VA (步驟同螯合 物與載體蛋白的偶聯）。
[0099] 超濾：
[0100] 偶聯結束后，將混合物轉移至預先處理好的Millipore超濾管（先用去離子水冰 浴0. 5h，再用預冷的HBS緩沖液冰浴0. 5h)中，BSA抗原用30KD的超濾管，0VA抗原用10KD 超濾管。先用0. 01M PH 9. 0的HEPES緩沖液稀釋（終體積為3ml)超濾1次，然后再用0. 1M PH 7. 4的HEPES緩沖液稀釋超濾3次，分別于3500rpm，4°C離心10min，最后兩次均用移液 槍小心吹洗濾膜，以免膜上有蛋白殘留，超濾結束后小心將內管底部的液體吸出，即為完全 抗原Cd-DTPA-BSA/OVA，及無金屬抗原DTPA-BSA/OVA ;收集超濾液進行檢測以觀察是否有 蛋白損失。
[0101] 2、完全抗原的鑒定
[0102] 對于制備的抗原，包括完全抗原（Cd-DTPA-BSA、Cd-DTPA-OVA)及無金屬抗原 (DTPA-BSA、DTPA-0VA)進行鑒定，其中最直觀也是最主要的是SDS-PAGE分子量檢測，另外 同時進行紫外及質譜鑒定。
[0103] SDS-PAGE分子量檢測的結果如圖2。
[0104] 通過SDS-PAGE檢測結果：與載體蛋白組對比，DTPA-載體蛋白、重金屬-DTPA-載 體蛋白的分子量逐漸變大，蛋白膠中遷移速率逐漸變慢，三者形成明顯的梯度，可以初步證 明完全抗原制備是成功的。
[0105] 紫外鑒定的結果如圖3。抗原組與載體蛋白的吸收峰發生了明顯的遷移：單純的 載體蛋白BSA的主要吸收峰為278nm處，DTPA-BSA的吸收峰移至約275nm處，而完全抗原 Cd-DTPA-BSA則無明顯的吸收峰；0VA組，單純的載體蛋白0VA在275nm處有一個主要的吸 收峰，DTPA-0VA則在270nm處有一個吸收峰，而Cd-DTPA-〇VA在265nm處達到最高值。完 全抗原組既有載體蛋白的特征，也有半抗原Cd-DTPA的特性，可以判斷完全抗原制備是成 功的。
[0106] 質譜鑒定的結果如表1。根據質譜檢測結果，與對照組相比，Cd的含量要遠遠高于 對照組，說明完全抗原重金屬的螯合是成功的。
[0107] 表1、抗原質譜鑒定結果
[0108]
[0109] 通過SDS-PAGE，紫外鑒定及質譜檢測（圖2, 3及表1)，可以證明本發明人成功制 備了完全抗原Cd-DTPA-BSA和Cd-DTPA-〇VA。由于完全抗原的成功制備是獲得重金屬抗體 的首要條件，為之后的抗體篩選奠定基礎，可以用于之后的抗體篩選工作。
[0110] 實施例2、Cd-納米抗體庫的篩選、富集
[0111] 1、篩選
[0112] 在駝類、鯊魚等動物體內存在特殊的單鏈抗體，這種抗體天然缺少輕鏈，故稱為重 鏈抗體（Heavy-Chain Antibodies,HCAbs)，重鏈可變區上可以結合的抗原最小單位稱之為 VHH 抗體（Variable domain of Heavy chain of Heavy chain antibody, VHH)，分子量約 13kDa，又稱為Nanobody。因其分子量小、易穿透組織，而使其很容易接近祀目標表面的溝、 裂縫以及被隱藏的抗原表位，能夠識別許多傳統抗體無法識別的抗原結合位點；另外，VHH 還具有穩定性高，水溶性高，易表達，成本低且可以無限量擴增，以及與特定抗原決定表位 結合的空間位阻小等優勢，這使得其在疾病的診斷等相關的試劑盒研制等方面有很大的優 勢。
[0113] 將未經免疫的駱駝體內的免疫B細胞中的VHH mRNA反轉錄為cDNA，然后將可變 區克隆到噬菌粒（Phagemid)內，將重組的噬菌粒轉化入E. coli TG1中，最后在輔助噬菌體 M13K07 (購自美國Stratagene公司）的輔助下包裝、擴增，利用噬菌體展示技術將VHH蛋白 片段展示在M13K07的表面，形成駝源性的天然單域重鏈抗體（VHH)庫。
[0114] 因為重金屬Cd (或重金屬螯合物Cd-DTPA)分子很小，抗體庫中特異性針對Cd (或 Cd-DTPA)的抗體很少，有很多針對載體蛋白或是螯合劑等的抗體。所以，為了降低非特異 性，本發明人采用兩種抗原即Cd-DTPA-BSA和Cd-DTPA-〇VA交替進行抗體庫的篩選，即第二 輪篩選時包被的是抗原Cd-DTPA-〇VA,后面的幾輪依次交替篩選,篩選進行七輪。由于抗原 的交替，所以加抗體庫的時候也要同時加入相對應的載體蛋白共同孵育，以吸附一些非特 異性抗體降低非特異性，圖4所示即為抗體庫篩選步驟。
[0115] 納米抗體第一輪庫的富集步驟如下：
[0116] 先準備宿主菌：取凍存的TG1甘油菌，在無菌操作臺將TG1菌液以劃線法劃于LB 平板上，以便于次日挑單菌落。
[0117] ⑴抗原包被
[0118] 取一定量的抗原Cd-DTPA-BSA加入到一定碳酸鹽包被緩沖液（pH = 9. 6)，使其終 濃度為30 μ g/ml，加入Nunc孔中，250 μ 1/孔，共3孔，37°C包被2h ;
[0119] (2)準備宿主菌：
[0120] 前日過夜培養的TG1平板，挑取一個單菌落于新鮮的2XTY培養基（10ml)中， 37°C搖床擴增培養，保證在第7步侵染時其0D600達到0. 4~0. 6 ;
[0121] (3)乙醇胺封閉
[0122] 10mM的乙醇胺溶液封閉活性位點：包被結束，將孔內液體扣干，用無菌的1XPBS 加滿孔洗滌1〇次，然后加入1〇禮的乙醇胺溶液，30(^1/孔，371：封閉111;
[0123] (4)BSA 封閉
[0124] 3%的BSA封閉潛在蛋白結合位點：將孔內液體扣干，用無菌的1XPBS加滿孔洗滌 10次，然后加入3%的BSA，300y 1/孔，37°C封閉1.5h ;
[0125] (5)加原始VHH抗體庫
[0126] 取原始噬菌體VHH庫液300 μ 1 (共約1013個噬菌體）與300 μ 1 3 %的BSA混合 (降低非特異性），然后以200 μ 1/孔的體積加入Nunc孔