特異性識別重金屬Cd的納米抗體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及單克隆抗體技術領域，更具體地，本發明涉及特異性識別重金屬Cd的 納米抗體及其應用。
【背景技術】
[0002] 隨著工業的迅速發展，鎘（Cd)的生產和使用不斷增加，環境鎘污染及其引起的疾 病不時可見報導。最近研究表明，一般人群中低劑量鎘環境暴露即可引起腎功能損傷、骨礦 密度降低、鈣排泄增加及生殖毒性。因此檢測環境中或樣品中的重金屬鎘的存在與否以及 存在量是非常重要的。
[0003] 傳統的重金屬離子檢測方法主要有原子吸收光譜法、紫外分光光度法、陽極溶出 伏安法、示波極譜法和各種儀器聯用技術，如電感耦合等離子體質譜法、電感耦合等離子體 原子發射廣譜分析等；這些分析方法雖然能夠對環境中的鎘離子進行有效分析，而且測量 精度較高，但它們大多需要大型儀器，成本高，樣品要經過消解，檢測步驟煩瑣，不適合現 場、在線分析檢測，難以適應現場抽查、大規模檢測的需求。
[0004] 重金屬免疫檢測方法為重金屬污染物檢測提供了另一種方式，這種方法檢測速度 快、費用低廉、易于現場使用。但是，重金屬的免疫檢測的關鍵在于重金屬特異性抗體的制 備。由于重金屬離子帶有電荷，能與動物體內生物分子發生強烈的不可逆反應，導致動物中 毒，因此，常規的制備抗體的方法得不到理想的抗體。并且，重金屬離子本身分子量很小不 具有免疫原性，且其本身帶有電荷，會與分子發生強烈的不可逆反應，所以需選擇合適的載 體蛋白以制成完全的免疫原。
[0005] 然而，即使獲得了合適的攜帶重金屬離子的免疫原，后續篩選抗體的過程仍然存 在較多的瓶頸，特別是在完全免疫原中金屬離子很小，篩選過程中獲得的特異性抗體很微 小，甚至難以鑒定到；而針對完全免疫原中金屬離子以外的材料如螯合劑、載體蛋白的特異 性抗體將占很大比例；因此篩選難度遠遠高于常規的單抗篩選方法。
[0006] 綜上，本領域需要開發用于檢測重金屬Cd的免疫檢測抗體，以期應用于實時重金 屬檢測。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于提供特異性識別重金屬Cd的納米抗體及其應用。
[0008] 在本發明的第一方面，提供一種特異性識別重金屬Cd的納米抗體，所述的納米抗 體的互補決定區具有下組的氨基酸序列：
[0009] SEQ ID N0:2 所示的 CDR1，
[0010] SEQ ID NO:3 所示的 CDR2,和
[0011] SEQ ID NO :4 所示的 CDR3。
[0012] 在一個優選例中，所述的納米抗體的骨架區具有下組的氨基酸序列：
[0013] SEQ ID N0:5 所示的 FR1，
[0014] SEQ ID N0:6 所示的 FR2，
[0015] SEQ ID NO:7 所示的 FR3,和
[0016] SEQ ID NO:8 所示的 FR4。
[0017] 在另一優選例中，所述的納米抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0018] 在本發明的另一方面，提供一種多核苷酸，其編碼所述的納米抗體。
[0019] 在本發明的另一方面，提供一種表達載體，該表達載體中含有所述的多核苷酸。
[0020] 在另一優選例中，所述的多核苷酸可以通過分子克隆技術克隆至表達載體pET28a 中，進行表達。
[0021] 在本發明的另一方面，提供一種宿主細胞（為非繁殖細胞），該宿主細胞中含有所 述的表達載體或其基因組中整合有所述的多核苷酸。
[0022] 在本發明的另一方面，提供一種產生納米抗體的方法，包括：培養所述的宿主細 胞，使之表達所述的納米抗體。
[0023] 在本發明的另一方面，提供一種納米抗體噬菌體（噬菌粒），其包括：噬菌體（噬 菌粒），以及展示于噬菌體表面的所述的納米抗體。
[0024] 在另一優選例中，所述的噬菌體是商業化噬菌體，即是常規用于進行蛋白展示的 噬菌體。例如，所述的噬菌體是Ml3絲狀噬菌體。
[0025] 在本發明的另一方面，提供所述的納米抗體或所述的納米抗體噬菌體的用途，用 于檢測重金屬Cd ;或用于制備檢測重金屬Cd的試劑或試劑盒。
[0026] 在另一優選例中，所述的用途為非診斷性的用途。較佳地，用于檢測來自人體或動 物體以外的樣品（如水、藥品、食品、農藥、飼料、飲品、保健品等）中的重金屬Cd。
[0027] 在本發明的另一方面，提供一種用于檢測重金屬Cd的試劑盒，所述的試劑盒中包 括所述的納米抗體或所述的納米抗體噬菌體。
[0028] 在一個優選例中，所述試劑盒中還包括固相載體，所述的納米抗體或納米抗體噬 菌體被固定于固相載體（如多孔板、蓋玻片、微珠）或游離存在。
[0029] 在另一優選例中，所述試劑盒中還包括：
[0030] 能與所述的納米抗體連接的可檢測標記物（如HRP)，所述的可檢測標記物被連接 于所述的納米抗體或分離地存在于試劑盒；和/或
[0031] Cd標準品或Cd偶聯物（為Cd與載體蛋白的偶聯物，如Cd-DTPA-BSA、 Cd-DTPA-〇VA)標準品；和/或
[0032] 與可檢測標記物相對應的底物；和/或
[0033] 酶聯免疫反應試劑（包括但不限于：包被（緩沖）液，洗滌（緩沖）液，封閉液，固 定液，終止液，顯色液）；和/或
[0034] 說明檢測重金屬Cd的方法的使用說明書。
[0035] 在本發明的另一方面，提供一種檢測待測樣品中重金屬Cd存在情況的方法，所述 方法包括：
[0036] 以所述的納米抗體或所述的納米抗體噬菌體作為重金屬Cd的檢測抗體，通過酶 聯免疫反應法來檢測待測樣品中重金屬Cd的存在情況。
[0037] 在另一優選例中，將待測樣品包被于固相載體上，以攜帶或不攜帶可檢測標記物 (以攜帶可檢測標記物的抗抗體進一步結合）的所述的納米抗體或所述的納米抗體噬菌體 作為檢測抗體，檢測重金屬Cd的存在情況。
[0038] 在另一優選例中，所述的方法為非診斷性的方法。所述的待測樣品是來自人體或 動物體以外的樣品（如水、藥品、食品、農藥、飼料、飲品、保健品等）。
[0039] 在本發明的另一方面，提供一種篩選特異性識別重金屬Cd的納米抗體的方法，所 述方法包括：
[0040] (1)將Cd分別與載體蛋白BSA、0VA偶聯，分別獲得Cd與BSA偶聯物和Cd與0VA 偶聯物；
[0041] ⑵分別以⑴獲得的Cd與BSA偶聯物和Cd與0VA偶聯物作為抗原，篩選納米抗 體庫，富集與之特異性結合的納米抗體；篩選方案為以Cd與BSA偶聯物和Cd與0VA偶聯物 交替進行篩選，篩選3-8輪；
[0042] (3)應用酶聯免疫反應法來鑒定特異性識別重金屬Cd的納米抗體，獲得特異性良 好的納米抗體。
[0043] 本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0044] 圖1、本發明的實施例中進行的研究工作的整體流程步驟示意圖。
[0045] 圖 2、SDS-PAGE 分子量檢測的結果。其中，1、Marker ;2、BSA ;3、DTPA-BSA ; 4、Cd-DTPA-BSA ;5、0VA ;6、DTPA-0VA ;7、Cd-DTPA-〇VA ;8、Cd-DTPA-BSA 超濾液；9、 Cd-DTPA-〇VA 超濾液。
[0046] 圖3、抗原紫外檢測圖譜。
[0047] 圖4、噬菌體VHH庫的富集篩選示意圖。
[0048] 圖5、Cd-DTPA抗體庫第一至七輪抗體庫富集度。
[0049] 圖6、Cd-DTPA抗體庫富集度及特異性檢測。
[0050] 圖7、第四輪單克隆ELISA驗證。
[0051] 圖8、第六輪單克隆ELISA驗證。
[0052] 圖9、Cd-單克隆噬菌體VHH-螯合物競爭性ELISA示意圖。
[0053] 圖10、第四輪陽性單克隆特異性初檢測。
[0054] 圖11、第六輪陽性單克隆特異性初檢測。
[0055] 圖12、Cd-VHH-螯合物競爭性ELISA結果。
[0056] 圖 13、Cd-DTPA-VHH 4-18 親和常數 Kaff 測定。
[0057] 圖14、Cd-DTPA-VHH 4-18與DTPA濃度關系摸索結果。
[0058] 圖 15、Cd-DTPA-VHH 4-18 與 Cd-DTPA 及 DTPA 間接競爭性 ELISA。
[0059] 圖16、間接競爭性ELISA標準抑制曲線。
[0060] 圖17、測定Cd-單克隆抗體（Cd-DTPA-VHH 4-18)與其他重金屬的交叉反應的間接 競爭性ELISA標準抑制曲線。
[0061] 圖18、間接競爭性ELISA檢測法檢測加強的水樣。
【具體實施方式】
[0062] 本發明人經過深入的研究和試驗，揭示了一種針對重金屬Cd的納米抗體，所述的 納米抗體對于重金屬Cd具有良好的特異性，與其它金屬的交叉反應性很低。本發明的納米 抗體可靈敏檢測重金屬Cd，重復性好，結果穩定；利用所述的納米抗體，可制備方便、快速 且準確地檢測重金屬Cd的試劑盒。
[0063] 術語
[0064] 如本文所用，所述的"納米抗體"是指缺失輕鏈的重鏈抗體（如：來源于駱駝體 內），克隆其可變區得到的單域抗體，是最小的功能性抗原結合片段，相對分子質量（Mr)僅 約為15000。納米抗體具有分子質量小、穩定性強、可溶性好、易表達，免疫原性低等特點。 [0065] 如本文所用，所述的"檢測抗體"是指特異性地抗重金屬Cd的抗體。
[0066] 如本文所用，所述的"可檢測標記物"是指位于檢測抗體上的，用于確定待檢測樣 品中重金屬Cd的存在與否以及存在的量的標志物。如：酶、熒光標記、核素、量子點、膠體金 等。優選的，所述的標記物選自：辣根過氧化物酶（HRP)、堿性磷酸酯酶（AP)、葡萄糖氧化 酶、β -D-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶、或葡萄糖淀粉酶。
[0067] 如本文所用，所述的"與可檢測標記物相對應的底物"是指可被檢測抗體的標記物 所催化顯色，用于顯示檢測抗體與重金屬Cd發生結合的識別信號。所述的底物比如：用于 辣根過氧化物酶的鄰苯二胺（0PD)、四甲基聯苯胺（TMB)、ABTS ;用于堿性磷酸酯酶的對硝 基苯憐酸酯（p-nitrophenyl phosphate，p-NPP);等等。
[0068] 抗重金屬Cd蛋白的納米抗體
[0069] 本發明提供了一種納米抗體，所述的納米抗體篩選自駝源性天然單域重鏈抗體 庫。
[0070] 本發明所述的納米抗體，能高親和力特異性與重金屬Cd結合。
[0071] 本發明也包括所述的納米抗體的變異體、衍生物和類似物。如本文所用，術語"變 異體"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持本發明的納米抗體相同的生物學功能或活性 的多肽。本發明的多肽變異體、衍生物或類似物可以是（i)有一個或多個保守或非保守性 氨基酸殘基（優選保守性氨基酸殘基）被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是 也可以不是由遺傳密碼編碼的，或（ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽， 或（iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽（如前導序列或分泌序列或用 來純化此多肽的序列或多肽原序列，或融合多肽）。根據本文的定義這些變異體、衍生物和 類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
[0072] 此外，在所述的納米抗體的氨基端或羧基端還可添加其它基本上不影響本發明所 述的納米抗體的活性、表達量和穩定性的氨基酸序列。較佳地，這些添加的氨基酸序列有利 于表達（如信號肽），有利于純化（如6 X His序列），或其它可促進所述的納米抗體的活性、 表達量或穩定性的序列。
[0073] 本發明還包括編碼本發明的納米抗體或其變異體、衍生物的DNA分子。所述的DNA 分子可以全部人工合成，也可用PCR擴增的方法獲得。
[0074] 為了進一步提高宿主細胞的表達量，可以對本發明的納米抗體的編碼序列進行改 造，例如采用宿主細胞偏好的密碼子，消除不利于基因轉錄及翻譯的序列。
[0075] 在獲得了編碼本發明新納米抗體或其變異體、衍生物的DNA序列之后，將其克隆 入合適的表達載體，再轉入合適的宿主細胞。最后，培養轉化后的宿主細胞，通過分離純化 得到本發明的新的納米抗體。
[0076] 如本文所