法可根 據疾病類型、受試者狀況和靶向部位等條件適當選擇。給予方法的實例包括但不限于靜脈 內給予、皮內給予、皮下給予、肌內給予、經鼻給予、□服給予等。
[0080] 此外，本發明涉及用于預防或治療癌癥的試劑盒，其包括上述WT1輔助肽、WT1多核 苷酸或WT1表達載體作為必需成分。試劑盒是這樣的試劑盒，其特征在于誘導抗原呈遞細 胞，所述抗原呈遞細胞通過上述MHC II類分子展示上述WT1輔助肽。同樣，除上述必需成分 以外，本發明的試劑盒可包括例如樣品的獲得工具、反應容器等。一般而言，試劑盒附有使 用說明書。可使用本發明的試劑盒有效獲得通過上述MHC II類分子展示WT1輔助肽的抗原 呈遞細胞，并通過給予所述細胞以治療或預防癌癥。
[0081] 另一方面，本發明涉及用于在具有上述MHC II類分子的受試者中測定WT1特異性 輔助性T細胞的存在情況或量的方法，所述方法包括以下步驟： (a) 使上述WT1輔助肽與上述MHC II類分子的復合物與得自受試者的樣品反應;然后 (b) 測定識別樣品中包含的復合物的輔助性T細胞的存在情況或量。
[0082] 得自受試者的樣品可以是任何樣品，只要它們具有含有淋巴細胞的可能性即可， 包括例如體液(例如血液和淋巴液）、組織等。WT1輔助性T細胞與MHC II類分子的復合物可 以是例如采用本領域技術人員已知的方法(例如生物素-鏈霉抗生物素方法)形成的例如四 聚體、五聚體等的形式。可通過本領域技術人員已知的方法測定識別這類復合物的輔助性T 細胞的存在情況或量。在本發明的該方面中，可對上述復合物進行標記。至于標記，可以使 用已知標記，例如熒光標記和放射性標記。通過標記，可簡單快速地測定輔助性T細胞的存 在情況或量。采用本發明這個方面的方法，使癌癥的診斷、預后等變得可行。
[0083]因此，本發明還提供包含WT1輔助肽與上述MHC II類分子的復合物的組合物，其用 于測定具有上述MHC II類分子的受試者中的WT1特異性輔助性T細胞的存在情況或量。 [0084]同樣，本發明提供包含WT1輔助肽與上述MHC II類分子的復合物的試劑盒，其用于 測定具有上述MHC II類分子的受試者中的WT1特異性輔助性T細胞的存在情況或量。
[0085]又一方面，本發明涉及用于測定具有上述MHC II類分子的受試者中的WT1特異性 輔助性T細胞的存在情況或量的方法，所述方法包括以下步驟： (a) 使上述WT1輔助肽與得自受試者的樣品反應;然后 (b) 測定樣品中所包含的細胞因子的存在情況或量。
[0086] 得自受試者的樣品可以是任何樣品，只要它們具有含有淋巴細胞的可能性即可， 包括例如外周血單核細胞、血液、體液、組織等，優選外周血單核細胞。上述步驟(a)中的反 應可采用常規技術通過使得自受試者的上述樣品中的上述WT1輔助肽反應來進行。本領域 的技術人員可適當地確定各步驟中樣品細胞的培養條件。樣品中包含的細胞因子的存在情 況或量可通過本領域技術人員已知的方法測定。細胞因子可以是能夠被輔助性T細胞誘導 的細胞因子，例如干擾素-γ和白介素-10。在本發明的該方面中，可對上述細胞因子進行標 記。至于標記，可以使用已知標記，例如熒光標記和放射性標記。使用上述細胞因子的存在 情況或量作為指標，簡單快速地測定WT1特異性輔助性Τ細胞的存在情況或量變得是可行 的。
[0087] 再一方面，本發明涉及使用WT1輔助肽與上述MHC II類分子的復合物獲得WT1特異 性輔助性Τ細胞的方法，所述方法包括以下步驟： (a) 使樣品與該復合物反應;和 (b) 獲得包含在樣品中并識別復合物的輔助性T細胞。
[0088]上文中描述了WT1輔助肽與上述MHC II類分子的復合物。樣品可以是任何樣品，只 要它們具有含有淋巴細胞的可能性即可，包括例如得自受試者的樣品（例如血液）、細胞培 養液等。例如，識別復合物的輔助性T細胞的獲得可采用本領域技術人員已知的方法進行， 例如FACS和MACS。可培養所得到的WT1特異性輔助性T細胞，并將其用于治療或預防各種癌 癥。
[0089]因此，本發明還涉及WT1特異性輔助性T細胞，其可通過使用WT1輔助肽與上述MHC II類分子的復合物獲得WT1特異性輔助性T細胞的方法獲得。
[0090] 此外，本發明涉及用于獲得WT1特異性輔助性T細胞的試劑盒，其包括WT1輔助肽與 上述MHC II類分子的復合物。
[0091] 又一方面，本發明涉及用于診斷癌癥的方法，所述方法包括使用上述WT1特異性輔 助性T細胞、通過上述MHC II類分子展示WT1輔助肽的上述抗原呈遞細胞或上述WT1抗體。優 選將WT1特異性輔助性T細胞用于本發明的診斷癌癥的方法中。例如可將上述輔助性T細胞、 抗原呈遞細胞或抗體與得自具有上述MHC II類分子的受試者的樣品一起溫育，或者給予具 有上述MHC II類分子的受試者，然后，例如，可測定輔助性T細胞、抗原呈遞細胞或抗體的位 置、部位、量等以診斷癌癥。可對上述輔助性T細胞、抗原呈遞細胞或抗體進行標記。通過標 記，可有效地進行本發明用于診斷癌癥的方法。
[0092]又一方面，本發明涉及用于診斷癌癥的試劑盒，其包括上述WT1特異性輔助性T細 胞、通過上述MHC II類分子展示WT1輔助肽的抗原呈遞細胞或者抗WT1輔助肽的抗體或抗編 碼所述肽的多核苷酸的抗體作為必需成分。
[0093]下面通過實施例對本發明進行具體詳細的描述，但不應將實施例理解為限制本發 明。 實施例
[0094] 實施例1 與MHC II類分子結合的候選WT1肽的選擇 為了查找與MHC II類分子結合的肽序列，采用Rammensee等人所示的方法(Rammensee 等，Immunogene tics 41:178-228,1995)。具體而言，使用表中右端欄所述程序以及 Rammensee等人的法則進行選擇。通過該方法，將WTI35肽限制到表1和表2所示的肽序列，將 WT186肽限制到表3和表4所示肽序列，和將WT1294肽限制到表5和表6所示肽序列。表1-6中的 左端欄表示作為候選肽序列的"適合性"。"〇"數越多，在Rammensee等人的法則中的適合性 越高。無標記表示適合性差。同樣，表1-6中"與MHC II類分子結合的候選肽序列"欄的括號 中氨基酸組別表示可從括號中所列氨基酸中選擇一個氨基酸。例如描述[FLM]是指選自氨 基酸組別F、L和Μ的一個氨基酸。同樣，描述[VYI(AL)]是指選自氨基酸組別V、Y和I的一個氨 基酸，或者選自氨基酸組別A和L的一個氨基酸。"X"表示其可以是任何氨基酸。右端欄表示 用于列舉候選肽序列的程序的"程序名稱"。
[0095] 接下來，從表1-6中直觀地選擇候選WT1肽，下表7中所示肽被鑒定為MHC II類分子 的優選候選肽，如下述分析了這些肽的實際功能。
[0096] [表7] 鑒定小鼠 MHC II類分子的肽候選物
[0097] m肽特異性細胞系的制備和細胞增殖能力的測定 首先，將上述WT1肽用弗氏不完全佐劑(Montanide ISA 51)乳化，以相當于100 yg/小 鼠的量用各種WT1肽皮內接種小鼠。免疫以一周的間隔進行3次，最終免疫1周后取出脾，制 備脾細胞。使用未免疫小鼠的脾細胞作為刺激物，以10天間隔刺激脾細胞3次，該未免疫小 鼠的脾細胞用與用于免疫各小鼠的相同的WT1肽進行脈沖并照射。然后，使用未免疫小鼠的 脾細胞作為刺激物進行第4次刺激，該未免疫小鼠的脾細胞用表7所示各種肽(WT1 35、WT186 或WT1294肽)進行脈沖和照射，并通過3H摻入實驗測定響應各種刺激物的增殖反應。與WT1肽 無關的0VA (卵清蛋白）肽用作對照肽。結果，用各WT135肽、WT186肽或WT1294肽免疫的小鼠脾 細胞對用WT1 35肽、WT186肽或WT1294肽進行脈沖的刺激物作出應答并增殖（圖1A-1C)。
[0098] 如上所述，使用未免疫小鼠的脾細胞以10天間隔體外刺激脾細胞3次，未免疫小鼠 的脾細胞用各種WT1肽進行脈沖和照射。然后當使用用上述各種肽進行脈沖并照射的未免 疫小鼠的脾細胞作為刺激物進行第4次刺激，并測定增殖反應時，將MHC I類抗體(Db抗體） 或MHC II類抗體(Ab抗體)加入培養液中，并測定3H摻入。結果，響應用各WT 135肽、WT 186肽和 WT1294肽進行脈沖的刺激物的增殖反應因加入MHC 11類抗體而被抑制（圖2A-2C)。
[0099] 如上所述，使用用各種WT1肽進行脈沖和照射的未免疫小鼠的脾細胞以10天間隔 體外刺激脾細胞3次。然后，使用經照射的不表達任何WT1蛋白的C1498細胞、用各種上述WT1 肽進行脈沖的C1498細胞或者通過導入WT1基因而表達WT1蛋白的C1498細胞作為刺激物，通 過 3H摻入來測定增殖反應。結果，響應與用于體內免疫相同的WT1肽進行脈沖的C1498細胞 和因導入WT 1基因而表達WT 1蛋白的C1498細胞，產生增殖反應（圖3)。這就揭示，通過內源性 WT1蛋白的胞內加工產生了WT135肽、WT186肽和WT1294肽，并展示在MHC II類分子上。從上述 事實來看，表明了這三種WT1肽是MHC II類限制性WT1肽。
[0100] 產IFN-y能力的測定 如上所述，使用用各種WT1肽進行脈沖和照射的未免疫小鼠的脾細胞，以10天間隔體外 刺激脾細胞3次。然后，使用ELISA試劑盒(BIOSOURCE Immunoassay Kit，Invitrogen)，測定 培養物上清液中IFN- γ和IL-4的濃度。結果，兩只獨立小鼠的脾細胞對用各種WT1肽進行脈 沖和照射的未免疫小鼠的脾細胞作出應答，并產生干擾素-γ，但幾乎不產生白介素-4 (圖 4)。這就表明這三種類型的WT1肽誘導Thl型的WT1特異性輔助性Τ細胞。
[0101] 實施例2 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的測定 將小鼠用僅WT1126肽(MHC I類）、WT1126肽(MHC I類）+ WT135肽(MHC II類）、WT1126肽 (MHC I類）+ WT186肽(MHC II類)或WT1126肽(MHC I類）+ WT1294肽(MHC II類)免疫3次，并 制備小鼠的脾細胞。然后，將脾細胞使用WT1126肽(MHC I類)體外刺激一次，第6天，使用用 WT1126肽(MHC I類)進行脈沖的RMAS細胞作為靶細胞，測定了細胞毒活性。未用WT1126肽(MHC I類)脈沖的RMAS細胞用作對照靶細胞。因此，與用僅WT1 126肽(MHCI I類)免疫的小鼠脾細胞 相比，用WT1126肽(MHC I類）+ WT1輔助肽(MHC II類)免疫的小鼠脾細胞更強地誘導WT1特 異性細胞毒性T細胞(圖5)。這就表明3種WT1肽(MHC II類)是WT1特異性輔助肽。
[0102] 實施例3 腫瘤植入實驗 將表達WT1的C1498白血病細胞以2.5 X 105個細胞/小鼠的比例皮下植入小鼠，自植 入后一周起，一周一次共3次，將50 yg/小鼠的WT135輔助肽與弗氏不完全佐劑一起皮內給予 (圖6)。作為對照，用生理鹽水替換WT1 35輔助肽與弗氏不完全佐劑一起皮內給予。測量皮下 腫瘤隨著時間變化的大小，計算無病存活率直到皮下植入后的第29天。結果，腫瘤在對照組 的所有小鼠中擴大，而在WT1 35輔助肽(MHC II類)免疫組中，10只小鼠中有4只的腫瘤增殖被 完全抑制（圖7)。同樣，WT135輔助肽免疫組與對照組之間看到顯著差異(p〈0.05)(圖8)。這 就表明，WT1 35輔助肽(MHC II類)是具有體內誘導腫瘤免疫能力的WT1肽。
[0103] 接下來，在開始上述實驗后第29天解剖小鼠，切取脾，使用脾細胞分析WT1特異性 免疫應答。簡單地說，當解剖WT135輔助肽(MHC II類)免疫組和對照組的小鼠時切取脾，制備 脾細胞。脾細胞用WT1126肽(MHC I類)刺激一次，在刺激后第6天，使用用WT1126肽(MHC I類） 進行脈沖的RMAS細胞作為靶細胞，測定了脾細胞的細胞毒活性。作為對照，使用RMAS細胞作 為靶細胞，測定了脾細胞的細胞毒活性。結果，在WT1 35輔助肽(MHC II類)免疫組的全部4只 小鼠中誘導WT1特異性細胞毒性T細胞（圖9)。另一方面，對照組的3只小鼠中非常弱地誘導 WT1特異性細胞毒性T細胞(圖10)。在一只小鼠中未誘導出WT1特異性細胞毒性T細胞。同樣， 明顯的是，與WT135輔助肽(MHC II類)免疫組相比，WT1特異性細胞毒性T細胞的誘導較低（圖 9和圖10)。這就表明，通過給予WT135 II類輔助肽，誘導了WT1特異性輔助性T細胞，并且通過 WT1特異性輔助性