癌抗原輔助肽的制作方法
【專利說明】
[0001 ]本申請是以下申請的分案申請：申請日：2010年4月22日；【申請號】 201080028991.4 ;發明名稱：同上。
技術領域
[0002] 本發明涉及WT1輔助肽、編碼所述肽的多核苷酸、由所述肽誘導的WT1特異性輔助 性T細胞、包含它們的用于治療/預防癌癥的藥物組合物。本申請要求2009年4月23日申請的 日本專利申請號2009-105286的優先權，日本專利申請號2009-105286的公開內容通過引用 結合到本文中。
【背景技術】
[0003] WT1基因（維爾姆斯瘤(Wilms' tumor) 1基因）是一種被鑒定為兒童期腎癌維爾姆 斯瘤誘發基因的基因（非專利文獻1和2)，并且是具有鋅指結構的轉錄因子。WT1基因最初被 認為是癌癥抑制基因。然而，隨后的研究表明，上述基因更合適充當造血器官腫瘤和實體癌 的癌基因（非專利文獻3_6)。
[0004] 由于WT1基因在許多惡性腫瘤中高表達，因此已經證實作為沒有突變的自身蛋白 的WT1基因產物是否存在體內免疫原性。結果表明，來源于在腫瘤細胞中高表達的WT1基因 的蛋白質被胞內加工成片段，所得到的肽與展示在細胞表面上的MHC I類分子形成復合物， 通過WT1肽疫苗接種可誘導識別這類復合物的細胞毒性T細胞(下文亦稱CTL)(非專利文獻 7-9)。研究還表明，用WT1肽或WT1 cDNA免疫的小鼠以高比率排斥植入的表達WT1基因的腫 瘤細胞(非專利文獻7和10)，但內源性表達WT1基因的正常組織不被誘導的CTL破壞(非專利 文獻7)。在此之前，有研究強有力的表明，不僅僅在小鼠中而且還在人中可誘導WT1特異性 CTL，而且這類CTL具有針對高表達WT1基因的腫瘤細胞的細胞毒活性，但對于內源性表達 WT1基因的正常細胞沒有細胞毒活性(非專利文獻7和10-14)。
[0005] 另一方面，據報道，為了有效地誘導CTL，對癌抗原有特異性的輔助性T細胞的存在 十分重要(非專利文獻15)。輔助性T細胞(CD4陽性T細胞)通過識別MHC II類分子與抗原呈 遞細胞上的抗原肽的復合物被誘導、增殖和激活。活化的輔助性T細胞產生IL-2、IL-4、IL-5、IL-6或干擾素（IFN)等細胞因子并促進B細胞和其它T細胞亞群的增殖、分化和成熟。因 此，有研究認為，與MHC II類分子結合的抗原肽通過誘導輔助性T細胞，有效地激活CTL等， 并提高免疫功能（非專利文獻16)。在此之前，有關WT1僅報道了與MHC II類分子的HLA-DRB1*0401和HLA-DRB1*0405結合的抗原肽(非專利文獻17和專利文獻1)，有必要尋找針對其 它亞型的抗原肽。
[0006] 現有技術文獻 專利文獻 專利文獻1:國際公開號W0 2005/045027 非專利文獻： 非專利文獻l:Daniel A. Haber等，Cell. 1990年6月29日；61(7):1257-69。
[0007] 非專利文獻2:Call KM等，Cell. 1990年2月9日；60(3): 509-20。
[0008] 非專利文獻3:Menke AL等，Int Rev Cytol. 1998; 181: 151-212。綜述。
[0009] 非專利文獻4:Yamagami T等，Blood. 1996年4月1 日；87(7):2878-84。
[0010] 非專利文獻5:Inoue K等，Blood. 1998年4月 15日；91(8):2969-76〇
[0011] 非專利文獻6:TsuboiA等，LeukRes. 1999年5月；23(5):499-505。
[0012] 非專利文獻7:0ka Y等，J Immunol. 2000年2月 15日；164(4): 1873-80。
[0013] 非專利文獻8:Melief CJ等，Immunol Rev. 1995年6月；145:167-77。
[0014] 非專利文獻9:Ritz J, J Clin Oncol. 1994年2月；12(2):237-8。
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[0016] 非專利文獻ll:〇ka Y等，Immunogenetics. 2000年2月；51(2):99-107。
[0017] 非專利文獻 12:0hminami Η等，Blood. 2000年 1月1 日；95(1): 286-93。
[0018] 非專利文獻13:Gao L等，Blood. 2000年4月1 日；95(7): 2198-203。
[0019] 非專利文獻14:0hminami Η等，Blood. 2000年1月1 日；95(1): 286-93。
[0020]非專利文獻 15:Cancer. Res. 62: 6438，2002〇
[0021] 非專利文獻 16:J. Immunol. Immunother. , 24: 195, 2001 〇
[0022] 非專利文獻 17:Cancer. Immunol. Immunother. 51: 271, 2002〇
【發明內容】
[0023]發明要解決的技術問題 因此，本發明要達到的目的是提供通過與各種MHC II類分子結合而誘導WT1特異性輔 助性T細胞的肽、編碼所述肽的多核苷酸、由所述肽誘導的WT1輔助性T細胞以及包含它們的 用于治療/預防癌癥的藥物組合物。
[0024]解決技術問題的技術手段 本發明人進行了深入研究以達到上述目的。結果發現，具有編碼WT1蛋白的連續氨基酸 序列的一部分的肽起癌抗原輔助肽的作用，換句話說，所述肽通過與MHC II類分子結合而 展示在抗原呈遞細胞上，并且誘導WT1特異性輔助性T細胞，且顯示該肽可用于治療/預防癌 癥的藥物組合物。
[0025]因此，本發明提供： (1) 一種肽，其具有由來源于WT1蛋白的連續氨基酸組成的氨基酸序列，并通過與MHC II類分子結合誘導WT1特異性輔助性T細胞，其中氨基酸序列選自： (a) SEQ ID N0:3所述氨基酸序列； (b) SEQ ID N0:4所述氨基酸序列； (c) SEQ ID N0:5所述氨基酸序列；和 (d) -種氨基酸序列，其中(a)-(c)所述氨基酸序列中一個或幾個氨基酸被取代、缺失 或添加； (2) (1)中的肽，其中氨基酸序列是SEQ ID N0:3所述氨基酸序列； (3) (1)或（2)中的肽，其中MHC II類分子選自DRB1*0101、DRB1*0405、DRB1*0802、DRB1* 0803^DRB1*090UDRB1*120UDRB1*1403^DRB1*150UDRB1*1502^DPB1*020UDPB1*0202^DPB1* 0402、DPB1*0501、DPB1*0901、DQB1*0301、DQB1*0302、DQB1*0401、DQB1*0501、DQB1*0601、DQB1* 0602和DRB5*0102; (4) (1)或（2)中的肽，其中MHC II類分子選自DRB1*0101、DRB1*0405、DRB1*1502、DPB1* 0201、DPB1*0202和 DQB1*0601; (5) 編碼（1)-(4)中任一項的肽的多核苷酸； (6) 包含(5)中的多核苷酸的表達載體； (7) 抗(1) - (4)中任一項的肽或(5)的多核苷酸的抗體； (8) -種用于治療或預防癌癥的藥物組合物，其包含（1)-(4)中任一項的肽、（5)中的 多核苷酸或(6)中的載體； (9) 一種用于治療或預防癌癥的方法，所述方法包括將有效量的（1)-(4)中任一項的 肽、（5)中的多核苷酸或(6)中的載體給予具有(3)或(4)中的MHC II類分子的受試者； (10) (1)-(4)中任一項的肽、（5)中的多核苷酸或(6)中的載體在治療或預防癌癥中的 用途； (11) 通過(3)或(4)中的MHC II類分子展示（1)-(4)中任一項的肽的抗原呈遞細胞； (12) -種用于誘導抗原呈遞細胞的方法，所述方法包括在（1)-(4)中任一項的肽的存 在下培養不成熟的抗原呈遞細胞，并從不成熟的抗原呈遞細胞中誘導通過(3)或(4)中的 MHC II類分子展示肽的抗原呈遞細胞； (13) (1)-(4)中任一項的肽所誘導的WT1特異性輔助性T細胞； (14) 一種用于誘導WT1特異性輔助性T細胞的方法，所述方法包括在(1)-(4)中任一項 的肽的存在下培養外周血單核細胞，并從外周血單核細胞中誘導WT1特異性輔助性T細胞； (15) -種誘導WT1特異性輔助性T細胞的藥盒，其包括(1)-(4)中任一項的肽作為必需 成分； (16) -種用于預防或治療癌癥的藥盒，其包括(1)-(4)中任一項的肽、（5)中的多核苷 酸或(6)中的載體作為必需成分； (17) -種在具有(3)或(4)中的MHC II類分子的受試者中測定WT1特異性輔助性T細胞 的存在情況或量的方法，所述方法包括以下步驟： (a) 使（1)-(4)中任一項的肽與得自受試者的樣品反應;然后 (b) 測定樣品中所包含的細胞因子的存在情況或量。
[0026] 發明的有益效果 按照本發明，可獲得與以下多種類型的MHC II類分子結合的WT1輔助肽：例如DRB1* 010UDRB1*0405^DRB1*0802^DRB1*0803^DRB1*090UDRB1*120UDRB1*1403^DRB1*150UDRB1* 1502、DPB1*0201、DPB1*0202、DPB1*0402、DPB1*0501、DPB1*0901、DQB1*0301、DQB1*0302、DQB1* 0401、DQB1*0501、DQB1*0601、DQB1*0602 和 DRB5*0102;還可獲得一種包含所述 WT1 輔助肽的 用于治療/預防癌癥的藥物組合物。因此，在各類受試者(具體地講大多數日本人具有上述 分子）中體內和體外誘導WT1特異性輔助性T細胞是可能的。因為本發明誘導了 WT1特異性輔 助性T細胞，因此也可能在高表達WT1的癌中有效地激活T細胞和B細胞。
[0027] 附圖簡述 圖1表示通過在用各種肽刺激各肽特異性T細胞系后測定細胞增殖得到的結果，所述細 胞系通過用3種肽(mWTl35、mWTl86和mWTl294)的每一種進行脈沖來制備。圖中，符號表示 無肽刺激。
[0028] 圖2表示通過在抗MHC I類或II類抗體存在下用各種相應肽刺激各肽特異性T細胞 系后測定細胞增殖得到的結果，所述細胞系通過用3種肽(mWTl 35、mWTl86和mWTl294)進行脈 沖制備。圖中，符號表示無肽刺激。縱坐標中的符號"cpm"表示每分鐘計數。
[0029] 圖3表示通過測定各WT1肽特異性T細胞系響應以下細胞進行的細胞增殖而得到的 結果：C1498細胞、用3種肽(mWTl 35、mWTl86和mWTl294)進行脈沖的C1498細胞以及強制表達 WT1蛋白的C1498細胞。縱坐標中的符號"cpm"表示每分鐘計數。
[0030] 圖4表示通過在用3種肽(mWTl35、mWTl86和mWTl294)進行脈沖制備的各肽特異性T細 胞系中測定產IFN-γ能力得到的結果。
[0031] 圖5表示通過測定3種肽(mWTl35、mWTl86和mWTl294)的CTL細胞毒活性而得到的結 果。?表示使用用WT1126肽(MHC I類限制性肽)進行脈沖的RMAS細胞進行實驗的結果。?表 示使用對照RMAS細胞進行實驗的結果。
[0032] 圖6表示在腫瘤植入實驗中進行腫瘤植入和免疫的時間序列的示意圖。在給小鼠 皮下植入表達WT1的白血病細胞后第7、14和21天用mWTl 35輔助肽進行免疫，以及在第29天進 行解剖。向下的白色箭頭表示皮內給予對照(PBS) (IFA/30 μL)的時間點。向下的黑色箭頭 表示皮內給予mWTl35輔助肽(50 yM/IFA/30 μL)的時間點。
[0033] 圖7表示用m W Τ13 5輔助肽免疫的小鼠中的腫瘤大小和無病小鼠群的比例。在用 mWTl35輔助肽免疫的小鼠中，10只小鼠中有4只無病。另一方面，在用對照免疫的小鼠中，9只 小鼠中不存在無病小鼠。
[0034]圖8表示在用mWTl35輔助肽免疫的小鼠中的無病存活率。
[0035]圖9表示CTL在用mWTl35輔助肽免疫的小鼠中的細胞毒活性。籲表示使用用mWTl126 肽(MHC I肽)進行脈沖的RMAS細胞進行實驗的結果。?表示使用對照RMAS細胞進行實驗的 結果。圓括號內的數字表示腫瘤大小(mm)。
[0036]圖