作為生物標記物的miRNA-124的制作方法
【專利說明】作為生物標巧物的m i RNA-124
[0001 ]本發明設及特別是與病毒感染結合的生物標記物領域。
[0002] 更具體而言，本發明設及用作病毒感染的診斷標記物的新型生物標記物。更具體 而言考慮的病毒感染是需要RNA剪接的病毒感染，且特別是逆轉錄病毒感染例如HIV和AID 相關狀況。本發明還設及關于所述感染且特別是HIV和AIDS相關狀況的治療的隨訪標記物。
[0003] 在高等真核生物中，信使RNA不W其功能形式直接轉錄，而是作為前信使RNA轉錄， 所述前信使RNA必須經歷許多加工事件，W便可由細胞翻譯機制閱讀。剪接是允許消除不需 要的序列（內含子），并連接有意義的序列（外顯子）的過程。高度協調的剪接事件在稱為剪 接體的大復合物中發生。該功能大復合物(megacomplex)是蛋白質和RNA的精屯、裝配，其需 要鑒定外顯子-內含子邊界。外顯子規律地可變剪接，意指它們或包括在最終成熟mRNA轉錄 物中或從最終成熟mRNA轉錄物中排除。近期的廣泛測序研究觀察到:超過90%的基因經歷 可變剪接。可變剪接的mRNA的產生被反式作用蛋白質系統調節，所述反式作用蛋白質與前 mRNA自身上的順式作用位點結合。此類蛋白質包括促進特定剪接位點的使用的剪接激活 物，和降低特定位點的使用的剪接阻遏物，分別結合在剪接增強子位點上（內含子剪接增強 子，ISE和外顯子剪接增強子，ESE)和剪接沉默子位點上（內含子剪接沉默子，ISS和外顯子 剪接沉默子，ISS )。
[0004] 特別是來自逆轉錄病毒科的病毒是全世界疾病的主因之一。可W在逆轉錄病毒科 中區分出=個亞科:腫瘤病毒、慢病毒和泡沫病毒。
[0005] 因為腫瘤病毒可W與癌癥和惡性感染相關，所W它們被運樣命名。可W提及例如 致白血病病毒（例如禽白血病病毒(ALV)、鼠白血病病毒(MULV)也稱為莫洛尼病毒、貓白血 病病毒(FELV)、人白血病病毒例如HTLV巧肌TLV2、猿猴白血病病毒或STLV、牛白血病病毒或 BLV、靈長類動物D型腫瘤病毒、其為乳腺腫瘤的誘導劑的B型腫瘤病毒、或引起快速癌癥的 腫瘤病毒(例如勞斯肉瘤病毒或RSV)。
[0006] 泡沫病毒對于給定細胞類型或給定物種表現相當低的特異性，并且它們有時與免 疫抑制現象相關;運是例如對于猿猴泡沫病毒(或SFV)的情況。
[0007] 因為慢病毒例如HIV負責緩慢進展的病理狀況，所W它們被運樣命名，所述病理狀 況非常頻繁地設及免疫抑制現象，包括AIDS。
[000引已知病毒且特別是逆轉錄病毒例如HIV依賴RNA剪接和剪接調節，W便在受感染個 體的細胞和組織內傳播和散布。
[0009]近來，已利用HIV是需要RNA剪接W表達關鍵病毒蛋白質的逆轉錄病毒的運一事實 來開發基于剪接抑制的新型策略，W對抗病毒感染且特別是AIDS(W0 2010/143169)。事實 上，HIV-I基因組表達9化的初級轉錄物，其不僅充當子代病毒的基因組RNA，還生成40種不 同的hiRNAdHIV-I使用四個多重可變5'剪接位點和八個多重可變3'剪接位點，W生成剪接的 mRNA種類。運些剪接的mRNA可W分成兩類:多重剪接的（2化)和單一剪接的（地WRNAdHIV-I 可變剪接的調節主要由于亞最佳剪接位點的存在而發生，所述亞最佳剪接位點減少通過剪 接信號的細胞剪接機制的識別。在病毒剪接位點處的剪接進一步通過ESE、ESS和ISS的存在 得到調節。
[0010] 在運個背景下，已開發了哇嘟衍生物，特別是8-氯-N-[4-(S氣甲氧基）苯基]哇 嘟-2-胺，其已顯示在nM濃度范圍下抑制HIV-I和HIV-2T細胞向性實驗室株的外周血單核細 胞(PBMC)W及不同亞型的臨床分離物中的復制(WO 2010/143169)。
[0011] 微小RNA(miRNA)，最廣泛的非編碼組，是一類約22nt非編碼RNA，其通過與祀mRNA 轉錄物的非編碼區化TR)結合來抑制基因表達化ai等人，化ture Genetics,第30卷，no.4， 第363-364頁，2002;Badel等人，Cell,第 136卷，no.2,第215-233頁，2009) emiRNA基因代表 約1-2%的已知真核生物基因組。預測提出每種miRNA可W祀向超過200種轉錄物，并且單一 mRNA可W通過多重miRNA得到調節（LIND0W，DNA Cell Biol.,第26卷（5)，第339-351 頁， 2007) DiniRNA由內源發夾形轉錄物生成且通過與祀mRNA的堿基配對而起作用，運導致mRNA 切割或翻譯阻遏，取決于堿基配對的程度。兩個加工事件導致成熟的miRNA形成:首先，將初 生miRNA轉錄物(pri-miRNA)加工成70個核巧酸的前體(pre-miRNA)，其從核中輸出且在細 胞質中被切割，W生成短的（長約22個核巧酸）成熟miRNA化邸，EMBO J.，第21卷，第4663-4670頁，2002) DiniRNA可W位于基因間或基因內。當基因間時，它們的表達與其他miRNA作為 簇進行協調(Altuvia等人，Nucleic Acids Research,第33卷，no.8,第2697-2706頁，2005， OzsoIak等人，Genes and Development，第22卷，no . 22,第3172-3183頁，2008)。當基因內 時，即置于蛋白質編碼基因內（幾乎唯一地在內含子內），它們通常從與它們的宿主基因相 同的鏈化 iu 等人，Cell Research,第 18 卷，no. 10,第 985-996 頁，2008 ,Kim 等人，EMBO 化 urnal，第26 卷，no. 3,第775-783 頁，2007)且 W相關聯水平(Baskerville等人，RNA，第11 卷，no. 3,第 241-247 頁，2005)表達。
[0012] miRNA近期已設及病毒感染中的宿主和病原體的復雜串擾，并且被認為在病毒發 病機理中起主要作用(NAIR，Trends in Microbiol.，第14卷，第169-175頁，2006)。事實上， 病毒是使用細胞機制用于其存活和復制的專性細胞內寄生物，因此運種依賴性使得它們對 宿主基因調節機制敏感。細胞miRNA可W參與抗病毒防御機制，但在一些情況下，還可W是 病毒正調節物。另一方面，病毒自身也可W產生miRNAW調節細胞過程或病毒基因。設及 HIV-I感染的miRNA可W根據其生物發生起源定義為HIV-I編碼的或宿主編碼的；它們還可 W根據其功能定義為感染的阻遏物或激活物。它們可W進一步根據它們是直接祀向HIV-I 轉錄物還是間接影響HIV-I進行分類，通過祀向設及病毒生命周期的宿主因子，或祀向HIV-IRNA基因組和HIV-I感染必需的宿主因子兩者。幾個數據證明HIV-I感染由于miRNA生物發 生干擾而總體影響miRNA途徑，W及通過miRNA表達概況修飾而個別影響miRNA途徑巧ouzet 等人，Biochim Bio地ys Acta.2011 Nov-Dec; 1809(11-12) :686-693))。此外，宿主miRNA 已描述為調節HIV-I。
[0013] 給定藥物或疫苗成功開發的一個關鍵因素是有效和快速評價其功效的可能性。事 實上，給定藥物或疫苗在其治療窗內進行施用是重要的，W便避免不需要的來自太高劑量 的效應，或避免由于太低劑量的功效缺乏。另外，必須確保將適當藥物或疫苗施用于適當患 者，并且該患者事實上響應藥物或疫苗。因此，僅僅將給定患者和給定藥物或疫苗聯系在一 起不一定足W獲得有利的療效。因此關鍵是有適當的工具，例如特異性生物標記物W依靠， 用于評價藥物或疫苗的功效。
[0014] 因此，存在對新型和靈敏的工具的需要，所述工具用于評價病毒感染，并且特別是 逆轉錄病毒感染，并且更特別是HIV(人免疫缺陷病毒)感染，W及此類狀況的治療功效。
[0015] 存在對新型生物標記物的需要，所述生物標記物用于評價對病毒感染，并且特別 是逆轉錄病毒感染，并且更特別是HIV感染的治療功效。
[0016] 存在對用于評價哇嘟衍生物功效的新型和靈敏的工具的需要，所述哇嘟衍生物是 病毒特別是逆轉錄病毒例如HIV，并且更特別是HIV-I和HIV-2的抑制劑。
[0017] 存在對用于評價患者對哇嘟衍生物的應答性的新型生物標記物的需要，所述哇嘟 衍生物用于預防或治療病毒感染，并且特別是逆轉錄病毒感染，并且更特別是HIV感染。
[0018] 存在對用于評價哇嘟衍生物的治療功效的新型生物標記物的需要，所述哇嘟衍生 物用于預防或治療病毒感染，并且特別是逆轉錄病毒感染，并且更特別是HIV感染。
[0019] 還存在對用于篩選藥物候選物或疫苗的新型生物標記物的需要，所述藥物候選物 或疫苗有效預防和/或治療病毒感染，并且特別是逆轉錄病毒感染，并且更特別是HIV感染。
[0020] 本發明有意滿足運些需要。
[0021] 根據其目的之一，本發明設及至少一種miRNA作為病毒感染或所述病毒感染的治 療性處理功效的生物標記物的用途，所述至少一種miRNA是miR-124。
[0022] 出乎意料的是，如下文實施例中詳述的，本發明人已觀察到:在由HIV毒株特別是 ADA-M R5 HIV毒株感染的PBMC中，miR-124的表達水平相對于未受感染的PBMC是減少的。
[0023] 更重要的是，本發明人已出乎意料地觀察到：用哇嘟衍生物例如式(I)或（II)的哇 嘟衍生物，且特別是8-氯-N-[4-(S氣甲氧基）苯基]哇嘟-2-胺處理外周血單核細胞 (PBMC)，所述PBMC由HIV毒株特別是ADA-M R5 HIV感染，導致病毒的去除和miR-124表達的 急劇增加(相對于對照13倍）。哇嘟衍生物可W在WO 2010/143169中所述的化合物中選擇且 如下文進一步描述。相應地，所述病毒感染的治療性處理可W是用哇嘟衍生物的處理。
[0024] 相應地，miR-124自身展現為有力工具，換言之展現為生物標記物，用于監控患如 下感染的個體內的病毒感染，特別是逆轉錄病毒感染例如HIV感染，W及用于監控由病毒特 別逆轉錄病毒感染例如由HIV感染的個體，并且用于監控用抗病毒藥物治療的此類個體，所 述抗病毒藥物特別是如下詳述的式(I)或（II)的哇嘟衍生物，并且特別是8-氯-N-[4-(S氣 甲氧基)苯基]哇嘟-2-胺。
[0025] 因此，通過提供確認患者接受適當藥物或疫苗治療的工具，即就劑量和時間而言， 通過監控miR-124的表達水平，能夠跟蹤人研究試驗或對人研究實驗執行質量控制，或者監 控對藥物方案或疫苗的患者順應性。miR-124生物標記物還可W用于優化給藥方案。因此， miR-124生物標記物可W與例如患者治療的管理、臨床試驗和基于細胞的研究結合使用。
[0026] 根據其另一個目的，本發明設及至少一種miRNA作為病毒感染的生物標記物的用 途，所述至少一種miRNA是miR-124，所述病毒優選逆轉錄病毒，并且更優選人免疫缺陷病毒 巧 IV)。
[0027] 根據其另一個目的，本發明設及至少一種miRNA作為用于篩選藥物候選物或疫苗 候選物的生物標記物的用途，所述至少一種miRNA是miR-124,所述藥物候選物或疫苗候選 物推測有效預防和/或治療病毒感染，特別是逆轉錄病毒感染，并且更特別是HIV感染。 [00%]根據其另一個目的，本發明設及至少一種miRNA作為用于評價候選化合物改變細 胞或蛋白質的生理活性的生物效應，特別是藥理學潛力的生物標記物的用途，所述至少一 種miRNA是miRNA-124。
[0029]在運方面，本文已顯示miR-124的表達水平在多種化合物的施用后改變，已知所述 多種化合物具有藥理活性。因此，本發明人已顯示miR-124構成了候選化合物的潛在藥理活 性的有關生物標記物。
[0030] 特別地，推測有效預防和/或治療病毒感染的藥物候選物或疫苗候選物可W是哇 嘟衍生物。
[0031] 特別地，推測有效預防和/或治療病毒感染的藥物候選物或疫苗候選物可W是式 (I)的哇嘟衍生物或其藥學可接受的鹽之一：
[0033] 其中
[0034] -n是1或2并且R獨立地代表氨原子、面素原子或選自下述的基團：（C廣C3)烷基；-Mi化基團，其中化和R2獨立地是氨原子或(C1-C3)烷基；（C1-C3)氣烷氧基;-N02基團；苯氧基； 和(C1-C4)烷氧基，
[00對 -R'是氨原子、面素原子或選自（C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基的基團，
[0036] -R"是氨原子或（打-C4)烷基。
[0037] 推測有效預防和/或治療病毒感染的藥物候選物或疫苗候選