步驟I所述培養皿中的子宮內膜組織加入到消化液中，靜置消化半小時，再加入等體積緩沖液稀釋消化液，緩沖液為含有0.5% m膠原蛋白酶的緩沖液中，靜置消化半小時，再用Iml槍頭吹打消化組織，將組織與稀釋過的消化液混勻，過200目篩網，使細胞分散、分離，去除未消化組織。經過篩網濾過的細胞用生理鹽水重懸，800g，離心洗滌lOmin，去除上清，再加入空白低糖DMEM培養基重懸細胞，800g，離心1min，收集細胞沉淀;再向細胞沉淀中加入實施例1提供的培養基，重懸細胞，使細胞濃度維持在3 X 105/ml，接種于T25細胞培養瓶，放置于37 °C,5% CO2培養基培養7天，中間每2?3天半量換液一次，干細胞逐漸貼壁生長；
[0040]步驟4:上述步驟2及步驟3所得貼壁細胞接種于T25細胞培養瓶繼續培養7天，用胰酶消化貼壁細胞，貼壁離心經過離心洗滌，接種于細胞共培養皿，上層為步驟2所述經血貼壁細胞，下層為步驟3所述子宮內膜貼壁細胞，細胞接種密度為I X 16細胞/ml，采用實施例I提供的干細胞培養基，共培養7天，細胞獲得大量擴增；
[0041 ] 步驟5:宮內膜干細胞凍存:當細胞擴增到I?3 X 17細胞時，按照(3?5) X 16細胞/ml加入Iml細胞凍存液。將含有細胞的凍存液轉移至1.5ml凍存管，凍存管放入凍存盒，凍存盒置于_80°C，24h后，再將凍存盒中的凍存管轉入-196°C液氮儲存，細胞凍存液配方為:體積百分比為40%的胎牛血清、體積百分比為10%DMS0(二甲基亞砜)、體積百分比為50%空白低糖DMEM培養基；
[0042]步驟6:宮內膜干細胞復蘇:將-196°C液氮儲存的宮內膜干細胞凍存管取出，迅速放置于40°C水浴鍋中，溶解l_2min，將Iml解凍細胞懸液轉移置15ml離心管，加入1ml體積的空白低糖DMEM培養基，充分混勻，800g，離心5min，重復洗滌一遍，再將實施例1提供的干細胞培養基加入細胞沉淀，以I X 16細胞/ml接種于T75細胞培養瓶，放置于37°C、5^^02培養基培養，可連續傳代20次以上。
[0043]對實施例2所述宮內膜干細胞鑒定方法如下:
[0044]I)形態特征:將細胞培養瓶放置于倒置顯微鏡下，顯微鏡連接攝像裝置，調整細胞視野并拍照，細胞呈長梭型，成簇排列。
[0045]2)細胞增長曲線繪制:傳代后把細胞重懸，得到細胞懸液，把懸液均勻加到I孔板中；24h開始進行細胞計數，以后每隔12h計數一次，每次取3孔細胞，分別計數，計數結果取3孔平均值，連續計數6天。根據細胞計數結果，以單位細胞數(細胞數/ml)為縱坐標，以時間為橫坐標繪制生長曲線。
[0046]3)細胞表面標志物檢測:用FITC\PE熒光標記抗體(CD29、CD105、CD90、CD117、⑶45、CD34、⑶73、⑶44、HLA_DR)直接標記細胞表面分子，通過流式細胞儀檢測表面標記物表達。
[0047]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【主權項】
1.干細胞培養基，其特征在于包含以下組分:低糖DMED培養基，胎牛血清，青鏈霉素雙抗溶液，硫酸慶大霉素，谷氨酰胺。2.根據權利要求1所述的干細胞培養基，其特征在于各組分按體積含量各占總體積百分比，低糖DMEM培養基占82 %，胎牛血清占15 %，青鏈霉素雙抗溶液占I %，硫酸慶大霉素占1%，谷氨酰胺占1%。3.一種培養宮內膜干細胞的方法，其特征在于包括將采集到的經血與子宮內膜組織分開收集，然后分別用如權利要求1或2所述的干細胞培養基進行培養分別得到經血貼壁細胞和子宮內膜貼壁細胞，再將經血貼壁細胞和子宮內膜貼壁細胞于細胞培養瓶培養，用胰酶消化收集貼壁細胞，接種于細胞共培養皿，再用如權利要求1或2所述的干細胞培養基進行培養。4.根據權利要求3所述的一種培養宮內膜干細胞的方法，其特征在于包括如下操作步驟: 步驟1:采集經血與子宮內膜組織，將經血轉移至含肝素鈉的無菌離心管中，子宮內膜組織轉移至無菌培養皿，離心管與培養皿用封口膜封住，24h內低溫(4?8°C)運輸至實驗室; 步驟2:將步驟I所得離心管中的經血與生理鹽水充分混合，然后與Ficoll分離液1:1疊加，離心，收集單個核細胞;生理鹽水重懸單個核細胞，離心洗滌，去除紅細胞、血小板、細胞碎片；離心的細胞沉淀用如權利要求1或2所述的干細胞培養基重懸并接種于T25細胞培養瓶，放置于37 °C,5%⑶2培養箱培養7天，中間每2?3天半量換液一次，干細胞逐漸貼壁生長； 步驟3:將步驟I所得培養皿中的子宮內膜組織加入到消化液中，靜置消化半小時，再加入等體積緩沖液稀釋消化液，再用Iml槍頭吹打組織，將組織與稀釋過的消化液混勻，過篩網，使細胞分散、分離，去除未消化組織;經過篩網濾過的細胞用生理鹽水重懸，離心，去除上清，再加入空白低糖DMEM培養基重懸細胞，離心，收集細胞沉淀;再向細胞沉淀中加入如權利要求1或2所述的干細胞培養基重懸細胞;接種于T25細胞培養瓶，放置于37°C、5 % CO2培養箱培養7天，中間每2?3天半量換液一次，干細胞逐漸貼壁生長； 步驟4:將步驟2及步驟3所得貼壁細胞接種于T25細胞培養瓶繼續培養7天后，用胰酶消化收集貼壁細胞，貼壁細胞經過離心洗滌，接種于細胞共培養皿，上層為步驟2所述經血貼壁細胞，下層為步驟3所述子宮內膜貼壁細胞，所述細胞接種密度為I X 16細胞/ml，采用如權利要求1或2所述的干細胞培養基，共培養7天，細胞獲得大量擴增； 步驟5:宮內膜干細胞凍存:當細胞擴增到I?3 X 17細胞時，按照(3?5) X 16細胞/ml加入Iml細胞凍存液;將含有細胞的凍存液轉移至1.5ml凍存管，凍存管放入凍存盒，凍存盒置于-80 0C，24h后，再將凍存盒中的凍存管轉入-196 0C液氮儲存； 步驟6:宮內膜干細胞復蘇:將儲存于_196°C液氮中的宮內膜干細胞凍存管取出，迅速放置于40°C水浴鍋中，溶解l_2min，取Iml解凍細胞懸液轉移至15ml離心管，加入1ml體積的空白DMEM培養基充分混勻，離心，重復洗滌一遍，再將本發明提供的干細胞培養基加入細胞沉淀，以I X 16細胞/ml接種于T75細胞培養瓶，放置于37°C、5 %CO2培養基培養，可連續傳代20次以上。5.根據權利要求4所述的一種培養宮內膜干細胞的方法，其特征在于所述步驟2中的生理鹽水含有I %青鏈霉素雙抗溶液;所述離心洗滌步驟包括2次離心，分別用生理鹽水重懸細胞沉淀，然后離心。6.根據權利要求4所述的一種培養宮內膜干細胞的方法，其特征在于所述步驟3中緩沖液為含0.5 % m膠原蛋白酶的磷酸緩沖液。7.根據權利要求4所述的一種培養宮內膜干細胞的方法，其特征在于所述步驟2中以細胞濃度3 X 105/ml接種于T25細胞培養瓶。8.根據權利要求4所述的一種培養宮內膜干細胞的方法，其特征在于所述步驟3中以細胞濃度3 X 105/ml接種于T25細胞培養瓶。9.根據權利要求4所述的一種培養宮內膜干細胞的方法，其特征在于所述步驟4中的離心洗滌步驟為用空白低糖DMEM培養基重懸細胞，800g，離心1min。10.根據權利要求4所述的一種培養宮內膜干細胞的方法，其特征在于所述的步驟5中的細胞凍存液配方為:體積百分比為40%的胎牛血清、體積百分比為10% 二甲基亞砜、體積百分比為50 %空白低糖DMEM培養基。
【專利摘要】本發明提供了一種干細胞培養基及使用該干細胞培養基培養宮內膜干細胞的方法，所述的辦法包括將采集到的經血與子宮內膜組織分開收集，然后分別用本發明提供的干細胞培養基進行培養分別得到經血貼壁細胞和子宮內膜貼壁細胞，再將經血貼壁細胞和子宮內膜貼壁細胞于細胞培養瓶培養，用胰酶消化收集貼壁細胞，接種于細胞共培養皿，再用本發明提供的干細胞培養基進行培養。該干細胞培養基成分簡單，添加成分較少，成本較低；體外培養20代以上，細胞不易出現衰老、退化現象，能長久維持干細胞的活性與干性；干細胞培養方法簡單、有效，細胞增殖效率快，體外培養倍增時間僅20小時左右；且細胞能夠穩定擴增50代。
【IPC分類】C12N5/074, A01N1/02
【公開號】CN105586308
【申請號】CN201610078092
【發明人】戴玲華, 戴唯悠
【申請人】杭州易文賽生物技術有限公司
【公開日】2016年5月18日
【申請日】2016年2月4日