干細胞培養基及培養宮內膜干細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種從經血中分離、培養宮內膜干細胞的方法以及使用到的干細胞培養基。
【背景技術】
[0002]大量研究已證明，宮內膜干細胞具有很強的再生能力，同時具有多分化潛能和低免疫原性，可作為細胞治療、組織工程的種子細胞，其應用前景廣闊。宮內膜干細胞最早是從刮宮組織中提取，隨著研究深入，人們發現從女性月經血中同樣能分離得到具有再生能力的干細胞，并且其獲取方式無侵害性，無倫理問題，方法更簡單、安全。從經血中獲取的宮內膜干細胞具有極強的再生能力，其主要表現:擴增快，倍增時間僅24小時左右，而骨髓干細胞倍增時間則需要更長。然而，現有培養技術條件下，宮內膜干細胞使用培養基成分較多，價格昂貴，且體外培養10代以上，細胞容易出現衰老、退化現象，增殖效率降低，且在培養基中添加較多的細胞生長因子，會促進干細胞分化，對于維持其干性與穩定性不利，影響干細胞儲存與研究質量。
【發明內容】
[0003]針對現有培養基成分較多、價格昂貴、細胞隨著擴增代次增加容易老化等問題，本發明提供一種經濟有效的干細胞培養基，其能夠穩定擴增干細胞，長久維持其活性與干性，同時提供有效促進干細胞生長的培養方法，通過經血與子宮脫落內膜分開收集、分離、共培養來獲得穩定、大量的干細胞。
[0004]為提供一種經濟有效的干細胞培養基，本發明采取如下的技術方案:
[0005]干細胞培養基，包含以下組分:低糖DMED培養基，胎牛血清(FBS)，青鏈霉素雙抗溶液，硫酸慶大霉素，谷氨酰胺。
[0006]作為優選，各組分按體積含量各占總體積百分比，低糖DMEM培養基占82%，胎牛血清占15 %，青鏈霉素雙抗溶液占I %，硫酸慶大霉素占I %，谷氨酰胺占I %。
[0007]本發明的另一目的在于提供一種培養宮內膜干細胞的方法，采取如下的技術方案:
[0008]—種培養宮內膜干細胞的方法，包括將采集到的經血與子宮內膜組織分開收集，然后分別用本發明提供的干細胞培養基進行培養分別得到經血貼壁細胞和子宮內膜貼壁細胞，再將經血貼壁細胞和子宮內膜貼壁細胞于細胞培養瓶培養，用胰酶消化收集貼壁細胞，接種于細胞共培養皿，再用本發明提供的干細胞培養基進行培養。
[0009]更具體的，一種培養宮內膜干細胞的方法，包括如下操作步驟:
[0010]步驟1:采集經血與子宮內膜組織，將經血轉移至含肝素鈉的無菌離心管中，子宮內膜組織轉移至無菌培養皿，離心管與培養皿用封口膜封住，24h內低溫(4?8°C)運輸至實驗室；
[0011]步驟2:將步驟I所得離心管中的經血與生理鹽水充分混合，然后與Ficoll分離液I: I疊加，離心，收集單個核細胞;生理鹽水重懸單個核細胞，離心洗滌，去除紅細胞、血小板、細胞碎片；離心的細胞沉淀用本發明提供的干細胞培養基重懸并接種于T25細胞培養瓶，放置于37 °C,5%⑶2培養箱培養7天，中間每2?3天半量換液一次，干細胞逐漸貼壁生長；
[0012]步驟3:將步驟I所得培養皿中的子宮內膜組織加入到消化液中，靜置消化半小時，再加入等體積緩沖液稀釋消化液，再用Iml槍頭吹打消化組織，將組織與稀釋過的消化液混勻，過篩網，使細胞分散、分離，去除未消化組織;經過篩網濾過的細胞用生理鹽水重懸，離心，去除上清，再加入空白低糖DMEM培養基重懸細胞，離心，收集細胞沉淀;再向細胞沉淀中加入本發明提供的干細胞培養基重懸細胞;接種于T25細胞培養瓶，放置于37 °C,5% 0)2培養箱培養7天，中間每2?3天半量換液一次，干細胞逐漸貼壁生長；
[0013]步驟4:將步驟2及步驟3所得貼壁細胞接種于T25細胞培養瓶繼續培養7天后，用胰酶消化收集貼壁細胞，貼壁細胞離心經過離心洗滌，接種于細胞共培養皿，上層為步驟2所述經血貼壁細胞，下層為步驟3所述子宮內膜貼壁細胞，所述細胞接種密度為I X 16細胞/ml，采用本發明提供的干細胞培養基，共培養7天，細胞獲得大量擴增；
[0014]步驟5:宮內膜干細胞凍存:當細胞擴增到I?3 X 17細胞時，按照(3?5) X 16細胞/ml加入Iml細胞凍存液;將含有細胞的凍存液轉移至1.5ml凍存管，凍存管放入凍存盒，凍存盒置于-80 0C，24h后，再將凍存盒中的凍存管轉入-196 0C液氮儲存；
[0015]步驟6:宮內膜干細胞復蘇:將儲存于_196°C液氮中的宮內膜干細胞凍存管取出，迅速放置于40°(:水浴鍋中，溶解l-2min，取Iml解凍細胞懸液轉移至15ml離心管，加入1ml體積的空白DMEM培養基充分混勻，離心，重復洗滌一遍，再將本發明提供的干細胞培養基加入細胞沉淀，以I X 16細胞/ml接種于T75細胞培養瓶，放置于37°C,5%CO2培養基培養，可連續傳代20次以上。
[0016]作為優選，所述步驟3中緩沖液為含0.5%ΙΠ膠原蛋白酶的磷酸緩沖液。
[0017]作為優選，所述步驟2中的生理鹽水含有I%青鏈霉素雙抗溶液;所述離心洗滌步驟包括2次離心，分別用生理鹽水重懸細胞沉淀，然后離心。
[0018]作為優選，所述步驟2中以細胞濃度3X 105/ml接種于T25細胞培養瓶。
[0019]作為優選，所述步驟3中以細胞濃度3X 105/ml接種于T25細胞培養瓶。
[0020]作為優選，所述步驟4中的離心洗滌步驟為用空白低糖DMEM培養基重懸細胞，800g，離心 lOmin。
[0021]作為優選，所述的步驟5中的細胞凍存液配方為:體積百分比為40%的胎牛血清、體積百分比為1 % DMSO (二甲基亞砜)、體積百分比為50 %空白低糖DMEM培養基。
[0022]本發明提供的干細胞培養基成分簡單，添加成分較少，成本較低;體外培養20代以上，細胞不易出現衰老、退化現象，能長久維持干細胞的活性與干性。
[0023]本發明提供的干細胞培養方法簡單、有效，細胞增殖效率快，體外培養倍增時間僅20小時左右;且細胞能夠穩定擴增50代。
[0024]而且通過本發明提供的培養宮內膜干細胞的方法培養得到的宮內膜干細胞具有如下特性:
[0025]I)形態特征:細胞培養瓶置于倒置顯微鏡下，可觀察到宮內膜干細胞成長梭性，成簇排列，第7代至第22代細胞形態均保持不變。
[0026]2)倍增時間:利用MTT法繪制細胞增長曲線，宮內膜干細胞的倍增時間在20小時左右。
[0027]3)表面標志物檢測:利用流式細胞術檢測細胞表面標志物，檢測出宮內膜干細胞具有間充質干細胞標志物典型特點:⑶29、⑶44、⑶73、⑶90、⑶105陽性;⑶34、⑶45、⑶117、HLA-DR陰性。
【附圖說明】
[0028]圖1是實施例2得到的干細胞第7代的形態圖；
[0029]圖2是實施例2得到的干細胞第20代的形態圖；
[0030]圖3是實施例2得到的干細胞增長曲線圖；
[0031 ]圖4是實施例2得到的干細胞的表面標志物鑒定。
【具體實施方式】
[0032]下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。
[0033]實施例1
[0034]干細胞培養基，按體積含量各占總體積百分比，低糖DMEM培養基占82%，胎牛血清占15 %，青鏈霉素雙抗溶液占I % ;硫酸慶大霉素占I % ;谷氨酰胺占I %。
[0035]實施例2
[0036]采用實施例1提供的干細胞培養基培養宮內膜干細胞的方法，包括如下步驟:
[0037]步驟1:利用經血采集裝置采集經血與子宮內膜組織，并將經血轉移至含肝素鈉的無菌離心管中，子宮內膜組織轉移至無菌的培養皿，用封口膜將離心管與培養皿開口處封住，24h內低溫(4?8 °C)運輸至實驗室；
[0038]步驟2:將步驟I所述離心管中的經血與等體積生理鹽水充分混合，生理鹽水含I %青鏈霉素雙抗溶液，用于抑制細菌增長。將經血與生理鹽水混合均勻，與Ficoll分離液1:1疊加，800g離心20min，收集白膜層單個核細胞。然后用生理鹽水重懸單個核細胞，800g離心lOmin，重復操作一遍，以去除紅細胞、血小板、細胞碎片等。離心的細胞沉淀用實施例1提供的培養基重懸，然后細胞按照3 X 105/ml接種于T25細胞培養瓶，放置于37 °C、5 % CO2培養基培養7天，中間每2?3天半量換液一次;干細胞逐漸貼壁生長；
[0039]步驟3:將