物純化等步驟后TA克隆進pMD19-T載體(購于TaKaRa公司)，挑選定向的雙陽性克隆進行測序，引物合成及測序工作均由上海生物工程有限公司提供。
[0021]1.4分子系統學分析
采用NIH網站BLAST軟件分析獲得的JRE反轉錄轉座子全長序列，同時在GenBank中進行比對，下載氨基酸序列相似性較高的其他物種ty3_gypsy氨基酸序列，使用Clustal W軟件進行分析，采用neighbor-joining構建系統進化樹進行分析。進化樹分析中所采用的序列為:Amphimedon queenslandica (XP-003390581.I)，Xiphophorus maculates(AF193865.), Saccoglossus kowalevskii (XP002732475.1), Azumapecten farreri(ABM90392), Mizuhopecten yessoensis (ABM90393), Oreochromis niloticus (XP_003460117)，Xenopus tropicalis (XP_002935079.2)，Dan1 rer1 (AF503912),Candidatus entotheonella (ETW98900), Clonorchis sinensis (GAA49140)。
[0022]1.5實驗結果 1.5.1 PCR擴增到全長
經過至少4個克隆的重復測序，獲得了轉座子的全長，通過BLASTX搜索GenBank分析和Staden Package 1.6軟件中的重復序列分析工具證實了該反轉錄轉座子具有LTR反轉錄轉座子的經典結構(圖1)，包含gag蛋白和pol蛋白結構域的編碼序列。其中pol結構域的基因順序為PR-RT-RH-1N，因而該轉座子屬于ty3-gypsy類型。JRE—共由5126 bp核苷酸構成，包括470 bp 5端LTR, 4203 bp ORF和453 bp 3端LTR。整個ORF編碼1401個氨基酸，5端LTR和3端LTR具有兩個倒轉重復的邊界序列TG...CA。JRE轉座子兩邊是以ATCTT為邊界的正向重復。LTR具有以TGT開始、以ACA結束的典型反向重復序列區，在LTR中也發現了多嘌呤位點，如位于203 bp處的AAAGGAGGTAA[25]，在5端LRT中具有與ser_tRNA 3’端互補的PBS序列。
[0023]根據JRE中間區域的RT、RH和IN基因推測的氨基酸序列進行了系統分析，采用Clustal W軟件進行序列比對，JRE轉座子與4下夷扇貝(Mizuhopecten yessoensis)具有40.7%的相似性。從系統發育樹可以看出，建鯉JRE轉座子和蝦夷扇貝、櫛孔扇貝、大堡礁海綿和斑劍尾魚等聚為一枝。
[0024]實施例2反轉錄轉座子轉座載體的構建 I實驗方法
引物設計、合成與基因測序:根據In -Fus1n技術原理，克隆引物設計時，在針對Survivin基因序列的上下游引物的外側分別引入經線性化的P -GCFU兩端各15個堿基，使克隆引物外側的15個堿基與線性化載體兩端的15個堿基序列同源，其中下游引物去除終止密碼的三個堿基。合成一對引物5’ACCGGACATATGCCCGGGGATACATCGCCCATCCCTACG3’， 5’CCTGCAGGAATTCCCGGGGATACATCGCCCATCCC T ACGS'oPCR 鑒定引物根據S urvivin和載體設計，其中上游引物位于Survivin，下游引物位于載體，且下游引物也用于后續陽性克隆的測序鑒定。引物合成和基因測序均由上海博尚生物技術有限公司完成。
[0025]以實施例1中獲得的PCR產物為模版，采用BamHI內切酶進行酶切，37°C lh。酶切產物經過I %瓊脂糖凝膠電泳后回收，方法同前，并溶于50yL滅菌雙蒸水中。獲得的酶切片段與由上海博尚生物公司合成的SEQ No 2采用T4 DNA連接酶進行4°C連接過夜，并采用DNA純化試劑盒純化連接產物。
[0026]Seq No 2的核苷酸序列為:
MCS AflII BlnI BsePI Eco52I Eco065I HaeII HpaI GATCC CTTAAG CCTAGG GGTNACC CGGCCG GGTNACC GTTAAC GCCGGC NheI Not I PvuI GCTAGC GCGGCCGC CGATCG G。
[0027]采用In-Fus1n PCR克隆試劑盒將連接產物與酶切后質粒DNA溶液進行交換反應，反應條件為室溫30min，制備克隆交換液。取200 yL感受態細胞懸液轉移到無菌的微量離心管中，加2 yL交換液，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30min ;將管放到預加溫到42 °C熱激90秒后快速將管轉移到冰浴1-2 min，每管加入800μ1 LB培養基;然后將管轉移到37 °(:搖床上振蕩培養(250rpm)45min使細菌復蘇;將100 μ?隨機挑取若干單菌落置于含lOOyg/mL氨芐青霉素的LB培養基中，37 °C振蕩培養過夜(16h).采用堿裂解法提取質粒，篩選陽性質粒進行測序鑒定。
[0028]2、結果
通過PCR反應成功獲得反轉錄轉座子基因DNA以及利用BamHI酶切并采用T4 DNA連接酶連接后的連接產物。用2μ1交換液轉化后獲得陽性克隆數約為103個，隨機挑取7個克隆進行PCR鑒定，僅一個克隆為假陽性，其余克隆的擴增片段大小與預期大小一致為4694bp，而陰性對照經1.5 %瓊脂糖電泳檢測未見條帶。隨機挑取任一PCR初步鑒定的陽性克隆經克隆測序結果與預期相一致。
[0029]實施例3反轉錄轉座子轉座載體的應用 I實驗方法
選取綠色熒光蛋白(GFP)作為報告基因，設計一對引物，引物兩端含AflII和NaeI酶切位點，采用PCR擴增GFP報告基因，per反應程序為:94 °C 30s、60 °C 5min、72 °C 45s，共30個循環，PCR產物經I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段，連接PMT18T載體(Takara)，測序驗證(中美泰和公司)。測序所得PCR產物和表達載體經酶切后經I %瓊脂糖凝膠電泳檢測回收。然后采用T4 DNA酶連接，與JRE轉座子載體相連接，連接產物仍采用IN-FUS10N技術克隆擴增。篩選到的陽性質粒送上海博尚公司進行測序，測序結果表明已經成功的將GFP基因插入到多克隆位(MCS )點中。
[0030]將篩選到的陽性質粒轉染建鯉肝細胞:在含10%胎牛血清、100IU/mL青霉素、100yg/mL鏈霉素的DMEM培養基中于5% CO2的細胞培養箱中培養建鯉肝細胞。當細胞覆蓋培養瓶底面70%左右時，將轉座子轉染肝細胞，具體分2組進行轉染:1)JRE轉座子500ng和2)空白對照。細胞的轉染用LipofectamineTM2000進行(具體操作見試劑說明書)。
[0031 ]基因捕獲克隆篩選:JRE轉座子載體轉染肝細胞24h后，經0.25%胰蛋白酶消化后轉入10寸盤，用含1000yg/mL G418的培養液培養兩周，經過G418的抗性篩選，待形成明顯克隆后，用槍頭小心轉接入96孔板，后按1: 2傳代，將獲得陽性細胞通過經酚/氯仿方法提取高純度的基因組DNA。進行PCR擴增檢測GFP基因的表達量。結果表明GFP基因成功的轉入到建鯉肝細胞基因組DNA中。
【主權項】
1.一種建鯉反轉錄轉座子，其特征在于，所述轉座子包含SEQID N0.1所示的核苷酸序列。2.—種人工設計合成的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列如SEQID N0.2所不O3.—種基因載體，其特征在于，所述的基因載體包含權利要求1所述的建鯉反轉錄轉座子和/或權利要求2所述的核苷酸序列。4.根據權利要求3所述的基因載體，其特征在于，所述的基因載體是以建鯉反轉錄轉座子為基本載體，在建鯉反轉錄轉座子中的1237位點插入如SEQ N0.2所示的核苷酸序列。5.一種基因轉移系統，其特征在于，所述的基因轉移系統包含: a)權利要求1所述的建鯉反轉錄轉座子，核苷酸序列SEQNo 1， b)權利要求2所述的核苷酸序列SEQNo 2。6.權利要求1所述的建鯉反轉錄轉座子在介導DNA導入細胞中的應用。7.權利要求3或4所述的基因載體以及權利要求5所述的基因轉移系統在介導DNA導入細胞中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種建鯉反轉錄轉座子及轉基因載體的構建方法和用途，所述轉座子包含SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列；一種人工設計合成的核苷酸序列，如SEQ？ID？NO.2所示；一種基因載體，所述的基因載體包含所述的建鯉反轉錄轉座子和/？或所述人工設計合成的核苷酸序列SEQ？ID？NO.2。所述的建鯉反轉錄轉座子和基因載體在介導DNA導入細胞中的應用。本發明通過在建鯉肝細胞中進行轉座活性驗證，證實上述轉座子具備轉座活性，所述的基因轉移系統能在建鯉肝細胞中進行高效轉座，因而本發明為進一步驗證轉座子的轉座效率以及采用該轉座子在脊椎動物中進行相關研究及應用奠定了基礎。
【IPC分類】C12N15/54, C12N15/85
【公開號】CN105567711
【申請號】CN201511016375
【發明人】丁煒東, 邴旭文, 曹麗萍, 曹哲明
【申請人】中國水產科學研究院淡水漁業研究中心
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2015年12月29日