一種建鯉反轉錄轉座子及轉基因載體的構建方法和用圖
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程領域，具體是涉及一種建鯉ty3-gypsy反轉錄轉座子JRE及其用途。
【背景技術】
[0002]DNA轉座子(transposon )是一類能在真核生物染色體上不斷移動位置的功能性DNA片段，對發現新基因和分析基因功能具有重要的作用，被認為是導致真核生物遺傳變異的主要原因之一。轉座子作為插入突變原或分子標簽已被廣泛用于基因的分離和克隆，一些甚至可作為轉化載體用于轉基因動植物的制備。piggyBac轉座子在果繩(Bactrocera tryoni，)[4]、家蠶(Bombyx mori)等昆蟲中，能作為一個高效、穩健的載體進行轉基因研究，并促進生殖種系轉化。家禽上也有報道利用mariner轉座元件可實現轉基因雞的制備。而在秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)中發現的Tc3轉座元件則已經成功轉化斑馬魚(Dan1 rer1)。根據轉座方式的不同，轉座子可分為DNA轉座子和反轉錄轉座子(retrotransposon)。其中，反轉錄轉座子是指以RNA為中介，反轉錄成DNA后進行轉座的可動元件，亦被稱為返座元(retroposon)。近幾年的研究表明返座元是真核生物中最重要的一類轉座元元件，也是目前所知高等植物中數量最大的一類可活動遺傳成分。按照序列結構中是否含有長末端重復序列(long terminal repeat, LTR)又可分為LTR反轉錄轉座子和無LTR反轉錄轉座子。
[0003]LTR反轉錄轉座子主要由2個開放閱讀框(open reading frames, ORFs)構成，即核心蛋白基因(gag)和酶基因區域(polhgag蛋白編碼類似于RNA病毒顆粒反轉錄相關的蛋白，Pol基因編碼逆轉錄過程中的主要蛋白，包括蛋白酶(PR)、反轉錄酶(RT)、RNase H和整合酶(INT) AT和RNase H是反轉子復制、轉座的關鍵酶，INT主要作用是使反轉錄轉座子插入到染色體中的新位點。由于pol基因同源性及INT蛋白的排列位置，LTR反轉錄轉座子又分為ty3_gypsy和tyl-copia兩大類。LTR逆轉錄轉座子采用的是“拷貝-復制”的機制，在宿主基因中不斷擴增；由于返座元帶有增強子、啟動子等調控元件，最終會參與到宿主基因的表達及新基因的產生等過程。目前在多種水生生物基因組中已經鑒定出一些LTR反轉錄轉座子，如斑馬魚、金魚(Carassius auratus)、團頭魴(Megalobrama amblycephala)等，但在建鯉中并沒有LTR轉座子的報道。反轉錄轉座子的這種插入導致產生變導的功能在魚類重要性狀相關基因的篩選、重要基因的功能研究以及轉基因動物等方面有著重要的研究和運用前景。例如，Tol2轉座系統已經用于多種動物的轉基因研究，成功獲得突變體，如果繩(Drosophila melanogaster)、斑馬魚、非洲爪蟾(Xenopus laevis) J^Gallusgallus)、小鼠(Mus musculus)等模式生物。
[0004]反轉錄轉座子作為一種新型高效的轉基因工具，正在被廣泛地研究與應用于轉基因育種、生物反應器、害蟲防治、基因功能研究等方面，具有廣闊的前景。例如，通過轉座子在體外構建編碼人們期望的有疾病抗性或改變生物體生長速度基因的載體質粒，將其導入受精卵，使之在染色體上正確整合，在組織細胞中適當表達，培養出具有期望性狀表型的轉基因新品系，從而在較短時期內培育出常規方法不能或需要長期培育才能育成的品種;借助一個高效的轉座載體，將外源基因導入生物內，使其穩定表達并遺傳，有助于人們對目的生物進行更加深入的研究，為體細胞遺傳學的研究和基因表達提供了一個高效、便捷的新系統，進而能改良經濟生物的生產性能。而現今面臨著轉基因的穩定性、安全性等問題，只有通過今后進一步深入研究轉座子系統及轉座機制和宿主因子對其轉化效率的影響，才能更好地推廣轉基因技術的發展。轉座子技術作為基因功能分子的重要工具，特別是對于功能基因組學研究來說，不僅要確定序列的編碼區和非編碼區，還要鑒定其相關的生物功能。總之，發現更多的轉座子及探明其結構機理，對于基因功能研究、育種等具有十分重要的意義。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種建鯉反轉錄轉座子及轉基因載體的構建方法和用途。
[0006]為實現上述目的，本發明采取的技術方案是:
一種建鯉反轉錄轉座子，其核苷酸序列含有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0007]一種分離的核苷酸序列，所述的核苷酸序列含有SEQ ID N0.2的核苷酸序列。
[0008]一種基因載體，所述的基因載體包含:SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
[0009]作為本發明的一種實施方式，所述的基因載體是以建鯉反轉錄轉座子為基本載體，作為本發明的另一種實施方式，所述的基因載體是以建鯉反轉錄轉座子JRE為基本載體，在JRE 1237位點處插入SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
[0010]—種基因轉移系統，包含:
a)所述的核苷酸序列SEQNo 1，
b)所述的核苷酸序列SEQNo 2。
[0011]所述的建鯉反轉錄轉座子JRE在介導DNA導入細胞中的應用。
[0012]所述的基因載體以及基因轉移系統在介導DNA導入細胞中的應用。
[0013]在研究中發現建鋰基因組中存在一個ty3-gypsy反轉錄轉座子類型的轉座子，將其命名為JRE轉座子，所述建鯉反轉錄轉座子JRE具有LTR反轉錄轉座子的經典結構(圖1)，包含gag蛋白和pol蛋白結構域的編碼序列。其中pol結構域的基因順序為PR-RT-RH-1N，因而該轉座子屬于ty3-gypsy類型。JRE—共由5126 bp核苷酸構成，包括470 bp 5端LTR，4203 bp ORF和453 bp 3端LTR。整個ORF編碼1401個氨基酸，5端LTR和3端LTR具有兩個倒轉重復的邊界序列TG...CA。JRE轉座子兩邊是以ATCTT為邊界的正向重復。LTR具有以TGT開始、以ACA結束的典型反向重復序列區，在LTR中也發現了多嘌呤位點，如位于203bp處的AAAGGAGGTAA[25]，在5端LRT中具有與ser_tRNA 3’端互補的PBS序列。
[0014]有益效果:本發明優點在于:
1、分離得到具有完整左右長末端重復序列的轉座子JRE，以及以此轉座子構建的轉座系統，并且在建鯉肝細胞中進行了轉座活性驗證。
[0015]2、本發明中所涉及到的轉座子來源于建鯉本身，因此在建鯉轉基因研究中具有更好的同源性，具有較高的轉座效率。
【附圖說明】
[0016]圖1、JRE轉座子結構圖開放閱讀框以長方形表示；2個三角形表示反向重復序列(TG...CA); gag，核心蛋白；pol，酶基因相關蛋白；PR，蛋白酶；RT，反轉錄酶；RH，RNA酶；IN，整合酶；PBS，PPT分別表示引物結合位置和多聚嘌呤位置.圖2 JRE轉座子分子系統樹構建；
圖3 JRE轉座子轉基因載體圖譜。
【具體實施方式】
[0017]下面通過【具體實施方式】結合附圖對本發明作進一步詳細說明。但本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
[0018]實施例1、建鯉ty3-gypsy反轉錄轉座子JRE的獲取和分析 1.1實驗魚
建鯉為本實驗室保存，采集血液進行基因組DNA提取。
[0019]1.2基因組DNA提取
采用大連寶生物工程有限公司Whole Blood Genomic DNA Extract1n Kit提取建鯉基因組DNA，主要步驟如下:取建鯉5尾，尾靜脈無菌采血，采集的血液10 HL使用含蛋白酶K和RNase A裂解液56°C消化15 min,然后加入200 pL 100%乙醇，進行過柱純化，最后使用elut1n buffer洗脫與膜結合的DNA，采用瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗。用蒸餾水將DNA樣品稀釋備用，其他樣品保存到-70°C備用。
[0020]1.3 PCR擴增與檢測
根據前期研究中建鯉基因組部分測序結果及Ty3-gypsy轉座子的保守區的相關文獻設計引物序列5 ’ GATACATCGCCCATCCCTACG3 ’，5 ’ GATACATCGCCCATCCCTACG3 ’，以上述所獲建鯉DNA 為模板，進行PCR 擴增，PCR 擴增混合物中含 10mmol/L Tris-HClCpH 8.4)、20mmol/LKCU10mmol/L (NH4)2S04、I.5mmol/L MgC12、0.lmmol/L 每種dNTPs、引物濃度為0.2ymol/L，約200ng。基因組DNA、2U Taq酶，反應總體積為SOyLt3PCR擴增程序為:94°C預變性5min后；98°C 10s,68°C 15min，共30個循環；最后再72°C延伸lOmin。取3yL PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后，在B1-Rad凝膠成像系統中照相記錄。獲得的基因片段的PCR產物經電泳分離、割膠回收、PCR產