一種人源脂肪干細胞來源的神經元細胞的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種人源脂肪干細胞來源的神經元細胞的制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002]細胞替代治療是重建受損神經系統的組織結構、恢復神經系統功能的一種有效策略。在細胞替代療法中，最關鍵的兩個問題是種子細胞的來源和種子細胞在體內的存活率。雖然干細胞作為種子細胞具有巨大的應用潛能，但其中多種干細胞卻涉及諸多問題而無法應用于臨床，例如，人類胚胎干細胞(human Embryonic Stem Cells,hESCs)雖然具有誘導成為神經細胞的潛能，但因涉及到倫理道德、致瘤性及免疫排斥等問題，無法作為種子細胞用于臨床治療；由人類成纖維細胞誘導成的全能性干細胞(human Fibroblast InducedPluripotent Stem Cells，iPSCs)雖然避免了倫理和免疫排斥問題，但是由于該技術帶來的病毒隨機整合造成的致瘤性和其它迄今無法預知的生物安全問題成為了 iPSCs用于臨床治療的阻礙。
[0003]為克服hESCs和iPSCs的上述種種不足，有科學家提出了將組織干細胞用于臨床治療。組織干細胞，也被稱為成體干細胞(Adult/Tissue Stem Cells，ASC)，是近來發現的一群存在于人體各組織器官內的具有多項分化潛能的干細胞。現階段研究較為廣泛的組織干細胞有間充質干細胞(Adult Mesenchymal Stromal Cells，MSCs)和骨髓間充質干細胞(Bone-Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells ,BMSCs) dMSCs可塑性較強，在臨床應用方面研究廣泛，已成為備受矚目的種子細胞。BMSCs用于臨床治療白血病已顯示出良好的效果，但由于BMSCs取材不易，且取材過程中給病人帶來的痛苦較大，獲得的材料中干細胞含量少，體外培養擴增速率慢且老化率高，因此，其臨床應用研究并不順利。最近的研究發現，脂肪組織來源的間充質干細胞(Adipose-derived Stem cells,ADSCs)，易于取材(只需通過負壓真空抽脂)，給病人造成的痛苦較小，獲得的脂肪組織中干細胞含量高，體外易于培養和傳代，具有多方向的分化潛能(如軟骨細胞、成骨細胞、肌細胞、心肌細胞、神經細胞、胰島細胞β等)，已成為細胞治療的研究熱點。
[0004]將脂肪干細胞定向分化為特定類型和功能的神經元，是實現脂肪干細胞用于臨床治療相應退行性神經性疾病的關鍵，在臨床治療退行性神經性疾病方面也擁有巨大的應用前景，但是，目前國內外對于脂肪干細胞定向分化為特定類型和功能的神經元的研究很少，對于脂肪干細胞向特定神經元細胞(例如運動神經元)分化的分子機理基礎以及誘導劑如何介導該特定分化過程的生物學信號通路(例如SHH、TGF_i3等)等并不清楚，導致轉分化的特異性和效率不高，而轉分化的效率和分化得到的運動神經元的功能性和特異性的不理想，極大的阻礙了脂肪干細胞在臨床上的應用。鑒于此，目前亟待提出一種可實現將脂肪干細胞定向分化為功能性運動神經元細胞、高效的制備脂肪干細胞來源的神經元細胞的方法。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是現有技術中對于脂肪干細胞的定向轉分化效率較低、分化得到的運動神經元的功能性和特異性不理想的問題，進而提供一種可實現將脂肪干細胞定向分化為功能性運動神經元細胞、高效的制備脂肪干細胞來源的神經元細胞的方法。
[0006]本發明的人源脂肪干細胞來源的神經元細胞的制備方法，包括以下步驟:
[0007](I)將人源脂肪干細胞體外分離、培養、鑒定；
[0008](2)將步驟I)中得到的所述人源脂肪干細胞，采用SHH和RA共同誘導分化為運動神經元細胞；
[0009](3)將步驟2)中得到的所述運動神經元細胞體外培養，使其成長為成熟的具有電生理功能的功能性運動神經元細胞。
[00?0] 需要說明的是，所述SHH是指Sonic Hedgehog;所述RA是指Retinoicacid;所述人源脂肪干細胞(簡稱為hADSCs)，可以通過從人體外科手術或者整形抽脂術獲得的脂肪組織中分離得到。
[0011]優選地，所述步驟(I)為:采用貼壁培養的方法從脂肪組織中分離篩選所述人源脂肪干細胞，從細胞的梭形形態和細胞表面標記表征分離獲得的所述人源脂肪干細胞，并用RT-PCR對分離獲得的所述人源脂肪干細胞進行鑒定;其中，所述細胞表面標記為CD免疫表面標記;所述RT-PCR鑒定所述人源脂肪干細胞的通用標記包括Sox2、0ct4、c-Myc、Nanog、KLF4中的一種或多種。
[0012]進一步優選地，所述貼壁培養的方法具體包括以下步驟:
[0013]將脂肪組織置于0.075%的I型膠原酶中，在37°C的溫度下消化，并在消化過程中每隔5分鐘搖動一次，40分鐘后用含10%血清、1%P/S的DMEM/F12培養基中和膠原酶，然后在1500rpm/min的轉速下離心10分鐘，棄掉上層油脂和上清，用含血清的培養基懸浮離心管底部的細胞團，并使其通過70um的細胞過濾器以去掉組織碎片；
[0014]將上述收獲的細胞濾液鋪到1cm的培養皿中，置于37°C下，在含5%⑶2濕度飽和的培養箱中培養24小時后，換液并用PBS沖洗，加入新鮮的培液繼續培養；
[0015]每3-4.5天換液一次，直至脂肪干細胞鋪滿皿底90 %后，用0.025 %胰蛋白酶消化處理傳代。
[0016]需要說明的是，本發明中所述的0.075%的I型膠原酶、10%血清等所有涉及百分比的溶液均指質量百分比。
[0017]優選地，所述步驟(2)還包括采用特異神經細胞標記蛋白表征獲得的所述運動神經元細胞的步驟;所述特異神經細胞標記蛋白為HB9或01 igo2中的一種或兩種。
[0018]進一步優選地，所述步驟(2)還包括利用電生理功能鑒定獲得的所述運動神經元細胞的步驟。
[0019]優選地，所述步驟(3)具體為:將步驟2)中得到的所述運動神經元細胞與原代神經細胞及神經營養因子共體外培養，使其成長為成熟的具有電生理功能的功能性運動神經
J L ο
[0020]進一步優選地，所述神經營養因子為BDNF、GDNF、IGF中的一種或多種。[0021 ] 對所述運動神經元細胞進行體外培養時，還用電生理檢測各個階段運動神經元的電生理活性及與原代神經細胞建立聯系的狀況。
[0022]本發明還提供了采用上述制備方法得到的功能性運動神經元細胞。
[0023]本發明所述的功能性運動神經元細胞在制備治療運動神經元損傷或退行性疾病的藥物領域的應用；優選地，本發明所述的功能性運動神經元細胞在制備治療脊髓損傷的藥物領域的應用。
[0024]本發明的上述技術方案，相比現有技術具有以下優點:
[0025](I)人源脂肪干細胞本身具有因取材容易、具有神經等多向分化潛能、體外分離培養簡單且獲得的干細胞數量多、傳代培養較骨髓間充質干細胞老化率低等優勢，而本發明采用SHH和RA誘導hADSCS體外分化為運動神經元，并研究調控分化的信號通路如SHH、TGF-13等，深入揭示調控脂肪干細胞向運動神經元分化的分子機理和調控該分化過程中的信號通路，實現了簡單易行、分化得率高的神經元細胞的制備，提高了脂肪干細胞向運動神經元定向分化的轉分化效率和特異性；
[0026](2)本發明通過追蹤脂肪干細胞及其分化獲得的細胞在脊髓損傷動物模型中的去向和分化狀況，得出了所述的功能性運動神經元細胞治療運動神經元損傷或退行性疾病的領域具有良好的療效。
【附圖說明】
[0027]為了使本發明的內容更容易被清楚的理解，下面結合附圖，對本發明作進一步詳細的說明，其中，
[0028]圖1A為實施例4中以Sox2、0ct4、c_Myc、Nanog、KLF4作為干細胞標記物在400X的顯微鏡下的分子圖；
[0029]圖1B為經過三次獨立實驗得到的干細胞標志物陽性率平均值；
[0030]圖1C為以Sox2、0ct4、c_Myc和Nanog為干細胞標志物對P3hADSCs進行RT-PCR檢測的結果圖；
[0031 ]圖2為實施例4中采用Tujl和NeuN進行免疫標記得到的免疫染色圖；
[0032]圖3為實施例4中檢測到表達MAP2和HB9的運動神經元的免疫染色圖；
[0033]圖4為實驗例中小鼠的冷凍切片的免疫染色檢測圖。
【具體實施方式】
[0034]實施例1
[0035]本實施例的人源脂肪干細胞來源的神經元細胞的制備方法，包括以下步驟:
[0036](I)將人源脂肪干細胞體外分離、培養、鑒定:采用貼壁培養的方法從脂肪組織中分離篩選所述人源脂肪干細胞，從細胞的梭形形態和細胞表面標記表征分離獲得的所述人源脂肪干細胞，并用RT-PCR對分離獲得的所述人源脂肪干細胞進行鑒定；
[0037]其中，所述細胞表面標記為⑶免疫表面標記;所述RT-PCR鑒定所述人源脂肪干細胞的通用標記為5(?2、0(^4、(3-]%(3、他1108、1(1^40
[0038](2)將步驟I)中得到的所述人源脂肪干細胞，采用SHH和RA共同誘導分化為運動神經元細胞；
[0039](3)將步驟2)中得到的所述運動神經元細胞體外培養，使其成長為成熟的具有電生理功能的功能性運動神經元細胞。
[0040]實施例2
[0041]本實施例的人源脂肪干細胞來源的神經元細胞的制備方法，包括以下步驟:
[0042](I)將人源脂肪干細胞體外分離、培養、鑒定:
[0043]將脂肪組織置于0.075%的I型膠原酶中，在37°C的溫度下消化，并在消化過程中每隔5分鐘搖動一次，40分鐘后用含10%血清、1%P/S的DMEM/F12培養基中和膠原酶，然后在1500rpm/min的轉速下離心10分鐘，棄掉上層油脂和上清，用含血清的培養基懸浮離心管底部的細胞團，并使其通過70um的細胞過濾器以去掉組織碎片；
[0044]將上述收獲的細胞濾液鋪到1cm的培養皿中，置于37°C下，在含5%⑶2濕度飽和的培養箱中培養24小時后，換液并用PBS沖洗，加入新鮮的培液繼續培養；
[0045]每3-4.5天換液一次，直至脂肪干細胞鋪滿皿底90 %后，用0.025 %胰蛋白酶消化處理傳代；
[0046]從細胞的梭形形態和細胞表面標記表征分離獲得的所述人源脂肪干細胞，并用RT-PCR對分離獲得的所述人源脂肪干細胞進行鑒定;其中，所述細胞表面標記為CD免疫表面標記；所述RT-PCR鑒定所述人源脂肪干細胞的通用標記為Sox2、Oc t4、c-Myc、Nanog、KLF4o
[0047](2)將步驟I)中得到的所述人源脂肪干細胞，采用SHH和RA共同誘導分化為運動神經元細胞，用特異神經細胞標記蛋白表征獲得的所述運動神經元細胞;所述特異神經細胞標記蛋白為HB9和01igo2。
[0048](3)將步驟2)中得到的所述運動神經元細胞體外培養