，使其成長為成熟的具有電生理功能的功能性運動神經元細胞。
[0049]實施例3
[0050]本實施例的人源脂肪干細胞來源的神經元細胞的制備方法，包括以下步驟:
[0051](I)將人源脂肪干細胞體外分離、培養、鑒定:
[0052]將脂肪組織置于0.075%的I型膠原酶中，在37°C的溫度下消化，并在消化過程中每隔5分鐘搖動一次，40分鐘后用含10%血清、1%P/S的DMEM/F12培養基中和膠原酶，然后在1500rpm/min的轉速下離心10分鐘，棄掉上層油脂和上清，用含血清的培養基懸浮離心管底部的細胞團，并使其通過70um的細胞過濾器以去掉組織碎片；
[0053]將上述收獲的細胞濾液鋪到1cm的培養皿中，置于37°C下，在含5%⑶2濕度飽和的培養箱中培養24小時后，換液并用PBS沖洗，加入新鮮的培液繼續培養；
[0054]每3-4.5天換液一次，直至脂肪干細胞鋪滿皿底90 %后，用0.025 %胰蛋白酶消化處理傳代；
[0055]從細胞的梭形形態和細胞表面標記表征分離獲得的所述人源脂肪干細胞，并用RT-PCR對分離獲得的所述人源脂肪干細胞進行鑒定;其中，所述細胞表面標記為CD免疫表面標記；所述RT-PCR鑒定所述人源脂肪干細胞的通用標記為Sox2、Oc t4、c-Myc、Nanog、KLF4o
[0056](2)將步驟I)中得到的所述人源脂肪干細胞，采用SHH和RA共同誘導分化為運動神經元細胞，用特異神經細胞標記蛋白表征獲得的所述運動神經元細胞;所述特異神經細胞標記蛋白為HB9和01igo2;同時，利用電生理功能鑒定獲得的所述運動神經元細胞。
[0057](3)將步驟2)中得到的所述運動神經元細胞與原代神經細胞及神經營養因子共體外培養，使其成長為成熟的具有電生理功能的功能性運動神經元；所述神經營養因子為BDNF、GDNF、IGF。
[0058]實施例4
[0059]本實施例的人源脂肪干細胞來源的神經元細胞的制備方法，包括以下步驟:
[0060](I)將人源脂肪干細胞體外分離、培養、鑒定:
[0061]將脂肪組織置于0.075%的I型膠原酶中，在37°C的溫度下消化，并在消化過程中每隔5分鐘搖動一次，40分鐘后用含10%血清、1%P/S的DMEM/F12培養基中和膠原酶，然后在1500rpm/min的轉速下離心10分鐘，棄掉上層油脂和上清，用含血清的培養基懸浮離心管底部的細胞團，并使其通過70um的細胞過濾器以去掉組織碎片；
[0062]將上述收獲的細胞濾液鋪到1cm的培養皿中，置于37°C下，在含5%⑶2濕度飽和的培養箱中培養24小時后，換液并用PBS沖洗，加入新鮮的培液繼續培養；
[0063]每3-4.5天換液一次，直至脂肪干細胞鋪滿皿底90 %后，用0.025 %胰蛋白酶消化處理傳代；
[0064]從細胞的梭形形態和細胞表面標記表征分離獲得的所述人源脂肪干細胞，并用RT-PCR對分離獲得的所述人源脂肪干細胞進行鑒定;其中，所述細胞表面標記為CD免疫表面標記；所述RT-PCR鑒定所述人源脂肪干細胞的通用標記為Sox2、Oc t4、c-Myc、Nanog、KLF4；
[0065]圖1A所示為以Sox2、0ct4、c_Myc、Nanog、KLF4作為干細胞標記物在400X的顯微鏡下的分子圖；圖1B為經過三次獨立實驗得到的干細胞標志物陽性率平均值；圖1C為以Sox2、0ct4、c-Myc和Nanog為干細胞標志物對P3hADSCs進行RT-PCR檢測的結果圖，由此可以說明，上述操作已成功分離脂肪干細胞的并已實現體外傳代培養；
[0066](2)將步驟I)中得到的所述人源脂肪干細胞，采用SHH和RA共同誘導分化為運動神經元細胞，用特異神經細胞標記蛋白表征獲得的所述運動神經元細胞;所述特異神經細胞標記蛋白為MAP2和HB9、Tujl和NeuN;同時，利用電生理功能鑒定獲得的所述運動神經元細胞。
[0067]采用TujI和NeuN進行免疫標記的結果如圖2所示;采用免疫染色技術檢測到表達MAP2和HB9的運動神經元，檢測結果如圖3所示。
[0068](3)將步驟2)中得到的所述運動神經元細胞與原代神經細胞及神經營養因子共體外培養，使其成長為成熟的具有電生理功能的功能性運動神經元；所述神經營養因子為BDNF、⑶NF、IGF;同時，在體外培養過程中用電生理檢測各個階段運動神經元的電生理活性及與原代神經細胞建立聯系的狀況。
[0069]實驗例
[0070]下面，為驗證本發明的技術效果進行以下實驗:
[0071]—、實驗步驟:
[0072]1、采用鉗夾法建立脊髓損傷小鼠模型:先用2%的水合氯醛麻醉小鼠，在顯微鏡下于T7部位背部剪開皮膚、皮下組織及肌肉組織暴露豎脊肌、脊突和椎板，用咬骨鉗打開硬脊膜，暴露脊髓;用下端磨平改裝過的鑷子鉗夾脊髓10秒鐘后放開。此時在顯微鏡下可見白色的脊髓因為鉗夾而形成一條暗帶即確定鉗夾成功；
[0073]2、用表達增強型綠色熒光蛋白的慢病毒標記脂肪干細胞及其分化獲得的運動神經元，采用原位注射的方法移植入脊髓損傷小鼠模型中。用包裝好的FG12慢病毒感染上述目標細胞，12-24小時后，棄掉病毒液，并用I X PBS沖洗，加入新鮮的含10%FBS和I %P/S的培養液培養細胞至48小時后，用倒置熒光顯微鏡在488激發光下觀察細胞表達綠色熒光情況，并計算感染率；
[0074]3、收集標記的細胞，通過原位注射的方法移植到造模成功7天后的脊髓損傷小鼠的脊髓損傷處，細胞注射量為5 X 16/只。
[0075]4、在不同時間節點，用心臟灌流法將小鼠灌注并用4%多聚甲醛(PFA)固定，取脊髓，再固定，用30%的蔗糖浸泡過夜，用OCT膠包埋后置于-80 °C冰箱中保存備用；
[0076]5、結合組織切片及免疫染色技術追蹤植入細胞在小鼠體內的去向和分化狀況，觀察脂肪干細胞用于臨床治療脊髓損傷和各種類型的運動神經元退行性疾病的效果。
[0077]6、用BBB評分，轉棒式疲勞儀和Foot Print等各種運動測試評估脊髓損傷小鼠在細胞注射前后運動功能的變化。
[0078]二、實驗結果
[0079]成功建立去脊髓損傷小鼠模型，并將標記綠色熒光蛋白的hADSCs移植到小鼠脊髓受損處，四周后灌注小鼠，取脊髓，冷凍切片并用免疫染色檢測，結果如圖4所示，其中，橫排第一排是低倍率的損傷部位的圖像;橫排第二排是在高損傷部位的圖像;橫排第三和第四排是創傷中心(前、后部分腔)的圖像;hADSC-MNs是用GFP標記、MAP2標記和DAPI標記。由此可見，運動神經元細胞在治療脊髓損傷方面具有良好的療效。
[0080]顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發明創造的保護范圍之中。
【主權項】
1.一種人源脂肪干細胞來源的神經元細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將人源脂肪干細胞體外分離、培養、鑒定； (2)將步驟I)中得到的所述人源脂肪干細胞，采用SHH和RA共同誘導分化為運動神經元細胞； (3)將步驟2)中得到的所述運動神經元細胞體外培養，使其成長為成熟的具有電生理功能的功能性運動神經元細胞。2.根據權利要求1中所述的人源脂肪干細胞來源的神經元細胞的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)為:采用貼壁培養的方法從脂肪組織中分離篩選所述人源脂肪干細胞，從細胞的梭形形態和細胞表面標記表征分離獲得的所述人源脂肪干細胞，并用RT-PCR對分離獲得的所述人源脂肪干細胞進行鑒定； 其中，所述細胞表面標記為CD免疫表面標記;所述RT-PCR鑒定所述人源脂肪干細胞的通用標記包括Sox2、0ct4、c-Myc、Nanog、KLF4中的一種或多種。3.根據權利要求2中所述的人源脂肪干細胞來源的神經元細胞的制備方法，其特征在于，所述貼壁培養的方法具體包括以下步驟: 將脂肪組織置于0.075%的I型膠原酶中，在37°C的溫度下消化，并在消化過程中每隔5分鐘搖動一次，40分鐘后用含10%血清、1%P/S的DMEM/F12培養基中和膠原酶，然后在1500rpm/min的轉速下離心10分鐘，棄掉上層油脂和上清，用含血清的培養基懸浮離心管底部的細胞團，并使其通過70um的細胞過濾器以去掉組織碎片； 將上述收獲的細胞濾液鋪到1cm的培養皿中，置于37°C下，在含5%C02濕度飽和的培養箱中培養24小時后，換液并用PBS沖洗，加入新鮮的培液繼續培養； 每3-4.5天換液一次，直至脂肪干細胞鋪滿皿底90 %后，用0.025 %胰蛋白酶消化處理傳代。4.根據權利要求1-3中任意一項所述的人源脂肪干細胞來源的神經元細胞的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)還包括采用特異神經細胞標記蛋白表征獲得的所述運動神經元細胞的步驟;所述特異神經細胞標記蛋白為HB9或Ol igo2中的一種或兩種。5.根據權利要求4中所述的人源脂肪干細胞來源的神經元細胞的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)還包括利用電生理功能鑒定獲得的所述運動神經元細胞的步驟。6.根據權利要求1-5中任意一項所述的人源脂肪干細胞來源的神經元細胞的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)具體為:將步驟2)中得到的所述運動神經元細胞與原代神經細胞及神經營養因子共體外培養，使其成長為成熟的具有電生理功能的功能性運動神經J L ο7.根據權利要求6中所述的人源脂肪干細胞來源的神經元細胞的制備方法，其特征在于，所述神經營養因子為BDNF、⑶NF、IGF中的一種或多種。8.根據權利要求7中所述的人源脂肪干細胞來源的神經元細胞的制備方法，其特征在于，對所述運動神經元細胞進行體外培養時，還用電生理檢測各個階段運動神經元的電生理活性及與原代神經細胞建立聯系的狀況。9.一種采用權利要求1-8中任意一項所述的制備方法得到的功能性運動神經元細胞。10.權利要求9所述的功能性運動神經元細胞在制備治療運動神經元損傷或退行性疾病的藥物領域的應用。
【專利摘要】本發明的人源脂肪干細胞來源的神經元細胞的制備方法，包括以下步驟：將人源脂肪干細胞體外分離、培養、鑒定；將得到的所述人源脂肪干細胞，采用SHH和RA共同誘導分化為運動神經元細胞；將得到的所述運動神經元細胞體外培養，使其成長為成熟的具有電生理功能的功能性運動神經元細胞。本發明的制備方法，實現了簡單易行、分化得率高的神經元細胞的制備，提高了脂肪干細胞向運動神經元定向分化的轉分化效率和特異性。
【IPC分類】A61P25/00, A61P25/28, C12N5/0793, A61K35/30, C12N5/0775
【公開號】CN105567636
【申請號】CN201610142883
【發明人】曹暉, 孫振華
【申請人】厚樸生物科技（蘇州）有限公司
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年3月14日