植物糖原納米顆粒及其制造方法
【專利說明】
[0001] 相關申請的引證
[0002] 本申請要求2013年4月26日提交的美國專利申請61/816686的優先權，并且其內容 由此W其整體并入。
技術領域
[0003] 本發明設及植物糖原(phytoglycogen)納米顆粒W及生產植物糖原納米顆粒的方 法。
【背景技術】
[0004] 植物糖原和糖原是由1,4-葡聚糖鏈組成的葡萄糖多糖，其通過α-1,6-葡萄糖巧鍵 高度支化，其在植物動物細胞中發揮儲能介質的作用。糖原W直徑為20-200nm的致密顆粒 的形式存在于動物組織中。糖原也發現積累在微生物中，例如細菌和酵母菌。植物糖原是一 種在結構和物理性質上與糖原相似的多糖，并且起源于植物。
[0005] 糖原和植物糖原被認為是"高度分散的"或非均質材料。對于已知的制劑，糖原典 型地具有處于1〇6和1〇8道爾頓之間的分子量，具有相應的大的多分散性。動物和植物組織W 及提取的糖原/植物糖原制劑的透射電子顯微鏡(TEM)觀察已經掲示了運些多糖的微粒性 質。常報道的糖原或植物糖原的顆粒直徑處于20-300nm的范圍內并且具有連續或多峰 (multimodal)尺寸分布。20-30nm的小顆粒被稱為β-顆粒，而100-300nm的大顆粒被稱為α- 顆粒。認為，α-顆粒是由β-顆粒聚集(aggregation)或群聚（clustering)組成的[1]。
[0006] 已經開發了各種方法從活有機體中分離糖原和植物糖原，最常見的是為了量化生 物樣品中積累的總糖原的量，并且偶爾為了將糖原在應用中用作產品。
[0007] 最常用的方法是從動物組織、特別是從海洋動物、尤其是軟體動物提取，因為它們 有能力積聚糖原。例如，美國專利5,734,045公開了通過使用熱堿提取、隨后使用陽離子樹 脂中和并處理所產生的溶液從蛛類制備不含蛋白質的糖原的方法。例如，在專利申請W0/ 1997/021828所描述的，糖原也可W通過酵母菌發酵來生產。美國專利7，670,812描述了一 種通過使酶的混合物與低分子量糊精接觸生物合成生產糖原樣多糖的方法。甜玉米和香稻 可作為糖原的來源;參見例如專利申請EP0860448B1，其描述了從香稻粒分離糖原的方法。 [000引糖原/植物糖原分離的主要步驟通常包括:通過粉碎/研磨/娠磨等破碎生物質;將 糖原提取到水相中；通過過濾和/或離屯、分離不溶性固體顆粒；消除微細分散或溶解的脂 質、蛋白質和低分子量污染物;和濃縮并干燥。
[0009] 為了提高第二提取步驟中糖原的收率，通常在提高的溫度下和/或使用堿性溶液 或酸性溶液進行提取。此種工藝包括使用熱的濃(20-40 % )堿溶液[2，3 ]、冷酸[4]或沸水 [引對研細的生物材料進行初始處理。
[0010] 在糖原分離/純化的常規方法中使用的工序導致糖原結構的大量水解、低分子量 產物的顯著增加和分子的化學改變。
[0011] 已經開發了各種較溫和的提取工序，諸如冷水提取[6]，并且得到的產物據稱接近 天然狀態的糖原的表現度。但是，已知由冷水提取法生產的糖原制劑是高度多分散的[7， 1]〇
[0012] 已知有多種方法用于進行從精細分散的蛋白質、脂質、核酸和其他多糖中純化粗 制糖原提取物的步驟。可W通過使用脫氧膽酸鹽(D0C)、S氯乙酸(TCA)、多價陽離子和/或 酶處理(蛋白酶、核酸酶）的選擇性沉淀來除去蛋白質和核酸。還已經使用通過將蛋白質鹽 析出來(例如使用硫酸錠)或通過離子交換W去除蛋白質的方法。蛋白質去除的另一種常用 方法是熱凝固，通常在65-100°C，隨后離屯、或過濾。高壓滅菌法（121°C，latm)也已經被用來 凝固蛋植物糖原提取物中的蛋白質[引。另外，可W使用酪水提取法除去蛋白質和脂質。
[0013] 國際專利申請公開號W0 2013/019977(化0)教導了一種獲得包括植物糖原的提取 物的方法，其包括超濾，但是也使水性提取物經受酶處理，運同時降解了植物糖原及其他多 糖。Yao提取了一種降低植物糖原粘度的方法，其通過使植物糖原經受β-淀粉分解，即使用 β-淀粉酶進行酶促水解。通過化0的方法產出的"經純化的植物糖原"不僅包括植物糖原，而 且包括植物原的衍生物，衍生物包括β-糊精和其他多糖的消化產物。化0的方法進一步包括 將提取物加熱至l〇〇°C (參見化〇的實施例1)。
[0014] 美國專利5,895,686公開了一種用于通過水或含水溶液(在室溫下)從水稻提取植 物糖原的方法，并且通過熱變性和TCA沉淀除去蛋白質。產物具有多峰分子量分布，相應地 具有高多分散性和大水溶液粘度。運些性質可歸因于來自植物材料的糖原制劑中大量支鏈 淀粉和直鏈淀粉的存在，還歸因于糖原提取過程中糖原的降解。
[0015] 美國專利5，597，913和5，734，045描述了產生基本不含含氮化合物和還原糖的糖 原的工序，指示了其不含蛋白質和核酸的純度。運些專利教導了選定組織在高pH溶液中沸 騰的使用。
[0016] 轉讓給本發明的擁有人的美國專利申請公開號US20100272639 A1提供了一種用 于從細菌和貝類生物質中分離糖原的方法。細菌被教導為是優選的，因為可W進行方法W 獲得不具有其他大分子量多糖(諸如支鏈淀粉和直鏈淀粉)并且不含與貝類或動物組織有 關的致病細菌、寄生蟲、病毒和航病毒的生物質。所公開的方法大體包括步驟:通過法式按 壓（French pressing)或通過化學處理進行細胞瓦解（disintegration);通過離屯、分離不 溶性細胞組分;通過酶處理、隨后滲析從細胞裂解物中除去蛋白質和核酸，其產生含有粗制 多糖和脂多糖(LPS)的提取物或，可替代地，酪-水提取;通過弱酸水解或通過多價陽離子的 鹽的處理(其引起不溶性LPS產物的沉淀)消除LPS;和通過超濾和/或尺寸排阻色譜法純化 富集了糖原的級分;和使用適合的有機溶劑沉淀糖原或可W通過超濾或超速離屯、法獲得濃 縮的糖原溶液;和冷凍干燥W產生糖原的粉末。從細菌生物質分離出的糖原的特點是MWt 5.3-12.7x 106Da，具有直徑為35-40nm的顆粒尺寸并且是單分散性的(PDI =Mn/Mw= 1.007- 1.03)。
【發明內容】
[0017] 在一個實施方式中，描述了一種從含有植物糖原的植物材料中獲得植物糖原納米 顆粒的組合物，通過動態光散射(DLS)測定，該植物糖原納米顆粒具有小于0.3的多分散指 數。在一個實施方式中，通過化S測量，植物糖原納米顆粒具有小于0.2的多分散指數。在一 個實施方式中，通過化S測量，植物糖原納米顆粒具有小于0.1的多分散指數。
[001引在一個實施方式中，植物糖原納米顆粒具有約30nm至約150nm之間的平均顆粒直 徑。在一個實施方式中，植物糖原納米顆粒具有約60nm至llOnm之間的平均顆粒直徑。
[0019] 在一個實施方式中，組合物基于干重包括多于80%的植物糖原納米顆粒，該植物 糖原納米顆粒具有約30nm至150nm之間的平均顆粒直徑。在一個實施方式中，組合物基于干 重包括多于90 %的植物糖原納米顆粒，該植物糖原納米顆粒具有約30nm至15化m之間的平 均顆粒直徑。在一個實施方式中，組合物基于干重包括多于99 %的植物糖原納米顆粒，該植 物糖原納米顆粒具有約30nm至150nm之間的平均顆粒直徑。在一個實施方式中，組合物基于 干重包括多于80 %的植物糖原納米顆粒，該植物糖原納米顆粒具有約60nm至llOnm之間的 平均顆粒直徑。在一個實施方式中，組合物基于干重包括多于90%的植物糖原納米顆粒，該 植物糖原納米顆粒具有約60nm至llOnm之間的平均顆粒直徑。在一個實施方式中，組合物基 于干重包括多于99 %的植物糖原納米顆粒，該植物糖原納米顆粒具有約60nm至llOnm之間 的平均顆粒直徑。
[0020] 在一個實施方式中，含有植物糖原的植物材料獲自玉米、水稻、大麥、高梁或它們 的組合。在一個實施方式中，含有植物糖原的植物材料是標準型（SU)或含糖增量劑 (surgary extender,se)型甜玉米。在一個實施方式中，含有植物糖原的植物材料獲自乳熟 期或凹陷期玉米粒。
[0021] 在一個實施方式中，組合物是粉末。在另一個實施方式中，組合物是植物糖原納米 顆粒的含水分散體。
[0022] 本文還描述了一種生產單分散性植物糖原納米顆粒的方法，包括:a.將破碎的含 有植物糖原的植物材料沉浸在約0和約50°C之間的水中；b.使步驟(a.)的產物經受固液分 離W獲得含水提取物;C.使步驟(b.)的含水提取物通過具有約0.05和0.15WI1之間的最大平 均孔徑的微濾材料;和d.使來自步驟C.的濾出液經受超濾W除去具有低于約300W)a的分子 量的雜質，從而獲得包含單分散性植物糖原納米顆粒的含水組合物。
[0023] 在方法的一個實施方式中，含有植物糖原的植物材料是谷物。在一個實施方式中， 谷物是玉米、水稻、大麥、高梁或它們的混合物。在一個實施方式中，含有植物糖原的植物材 料是標準型（SU)或含糖增量劑（se)型甜玉米。在一個實施方式中，含有植物糖原的植物材 料是標準型(SU)或含糖增量劑(se)型甜玉米的乳熟期或凹陷期巧粒。
[0024] 在一個實施方式中，方法包括步驟(e.)使包含單分散性植物糖原納米顆粒的含水 組合物經受使用淀粉薦糖酶、糖基轉移酶、支化酶或它們的任何組合的酶處理。
[0025] 在一個實施方式中，方法包括步驟(e.l)干燥包含單分散性植物糖原納米顆粒的 含水組合物，W獲得基本上為單分散性植物糖原納米顆粒的干燥的組合物。
[0026] 在一個實施方式中，方法包括在步驟C或步驟d之前添加吸附性過濾助劑。在一個 實施方式中，吸附性過濾助劑是娃藻±。