靶向h7流感病毒上中和表位的單克隆抗體的制作方法
【專利說明】革田向H7流感病毒上中和表位的單克隆抗體
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本發明申請設及并要求2012年11月19日提請的美國臨時專利申請系列號61/727， 927的優先權。運個申請通過引用并入本文。
[0003] 序列提交
[0004] 本申請和電子版的序列表一起提交。該序列表命名為 2577226PCTSequenceListing.txt ,2013年8月9日創建，大小為13化。序列表電子版的信息 W其全部內容通過引用并入本文。
[0005] 發明背景
[0006] 本發明設及鼠單克隆抗體(mAb)llB9和mAb 62及其活性片段，其均祀向甲型流感 H7血凝素的主要中和表位。本發明還設及使用鼠 mAb llB9、mAb 62或其片段預防和治療H7 流感的方法和組合物。本發明進一步設及確定、鑒別和/或定量(a)樣品或疫苗中甲型流感 血凝素或者(b)針對甲型流感血凝素的抗體的方法和試劑盒。
[0007] 本文中用于闡明本發明背景或者提供關于實踐的另外的詳細描述的出版物及其 它材料通過引用并入，方便起見歸類在參考文獻中。
[0008] 高致病性禽流感（HPAI)H7亞型在禽類中的發生持續是關注的公共衛生問題 (化化ao et al.，2008;Abbas et曰1.，2011)。2002年W來，來自歐亞和北美譜系的甲型流 感H7亞型病毒在荷蘭、意大利、加拿大、英國和美國已經導致100例W上的人感染。在2003 年，HPAI H7N7在荷蘭爆發，與感染禽類密切接觸的89人感染，并導致1人死亡。運些情況包 括2003年荷蘭HPAI H7N7病毒的爆發，導致超過80例人感染及1人死亡;HPAI H7N3病毒在 2004年在加拿大英屬哥倫比亞導致2例結膜炎;在2007年英國一群人感染低致病性禽流感 化PAI )H7N2病毒，導致幾例流感樣疾病和結膜炎;及在2003年在紐約的1例呼吸道感染。H7 亞型病毒已經呈現出顯著的大流行可能(Min et al. ,2010)。
[0009] 人對于H7禽流感病毒是免疫學天然的，循環于歐亞和北美的家禽和野禽中的LPAI H7亞型病毒具有進化和獲得高致病性表型的潛力，通過積累突變或者通過在血凝素(HA)裂 解位點重組導致在禽類中是毒性基序的高度可裂解的HA。近年來的研究也提示在2002- 2003年分離的現時北美譜系H7亞型病毒部分適于識別2-6-連接的唾液酸，其是人流感病毒 的優選受體及優先在人上呼吸道中發現(Gambaryan et al. ,2012)。此外，H7禽流感病毒與 人流感病毒包括季節性H1N1和H3N2及流行性H1N1病毒之間RNA基因組的共感染和遺傳重 配，可導致在人群中有效傳遞并導致流行的重配病毒的產生。家禽可作為重要的中間宿主 將野生禽流感病毒傳遞至人，豬也可W，如在2009年世界范圍內流行性H1N1流感病毒的豬 源人感染感染所證明。
[0010] 使用單克隆抗體的被動免疫被認為是治療許多感染性疾病的切實可行的選項。目 前已經有許多使用流感病毒HA1蛋白的中和抗體的治療方法(Prabakaran et al. ,2009)。 運種蛋白易于祀向，因為其在病毒表面上及運種蛋白的抗體可有效中和病毒。因此，H7血凝 素化A)的中和表位的單克隆抗體可W是人主動免疫接種的感興趣的另一選擇，特別是對于 處于流感感染高危中的那些個體，如免疫功能低下（immuno-compromised)的患者或者對主 動免疫應答不佳的老年人。重要的是任何mAb產物均應賦予針對循環中的H7流感毒株的廣 泛保護作用。
[0011]期望鑒別可用于預防和治療H7流感的單克隆抗體。
[0012] 發明概述
[0013] 本發明設及鼠單克隆抗體(mAb)llB9和mAb 62及其活性片段，其均祀向甲型流感 H7血凝素的主要中和表位。本發明還設及使用鼠 mAb llB9、mAb 62或其片段預防和治療H7 流感的方法和組合物。本發明進一步設及確定、鑒別和/或定量(a)樣品或疫苗中的甲型流 感血凝素或者(b)甲型流感血凝素的抗體的方法和試劑盒。
[0014] 因此，第一方面，本發明提供了特異于流感H5血凝素的主要構象表位的單克隆抗 體及其活性片段即抗原結合片段(在本文也稱作抗體片段）。在一個實施方案中，所述單克 隆抗體或其片段特異性結合H7血凝素化A)的構象表位，其中所述構象表位包含H7N7(A/ Netherlands/219/03)蛋白的全長HA蛋白的氨基酸136Ser、137Gly和227G1U，所述全長HA蛋 白包括信號蛋白。全長編碼序列示于SEQ ID N0:1，其相應于也包括5'和3'側翼序列的 〇6誠曰證登錄號4￥338459所示序列的核巧酸22-1710。全長蛋白序列示于569 10^:2。在另 一個實施方案中，所述單克隆抗體或其片段特異性結合鼠 mAb 11B9所特異性結合的H7血凝 素的構象表位。在再一個實施方案中，所述單克隆抗體是鼠 mAb 11B9。在進一步的實施方案 中，所述單克隆抗體是由鼠雜交瘤11B9產生的鼠 mAb 11B9。
[0015] 在一個實施方案中，所述單克隆抗體或其片段特異性結合H7血凝素化A)的構象表 位，其中所述構象表位包含全長HA蛋白的氨基酸17化ys和227G1U，所述全長HA蛋白包括信 號蛋白。在另一個實施方案中，所述單克隆抗體或其片段特異性結合鼠 mAb 62所特異性結 合的H7血凝素的構象表位。在再一個實施方案中，所述單克隆抗體是鼠 mAb 62。在進一步的 實施方案中，所述單克隆抗體是由鼠雜交瘤62產生的鼠 mAb 62。
[0016] 在另一個實施方案中，本發明提供了編碼本文所述單克隆抗體或其抗原結合片段 的核酸。在一個實施方案中，所述核酸編碼鼠 mAb 11B9或mAb62或者其抗原結合片段。在再 一個實施方案中，本發明提供了包含所述核酸的載體(vector)。在進一步的實施方案中，本 發明提供了包含和表達所述載體的細胞。
[0017]第二方面，本發明提供了使用鼠單克隆抗體mAb 11B9或mAb 62或其片段預防和治 療冊N1流感的方法和組合物。在一個實施方案中，本發明提供了一種藥物組合物，其包含本 文描述的單克隆抗體及藥物可接受的稀釋劑或運載體barrier)。在一些實施方案中，所述 單克隆抗體是鼠 mAb 11B9或mAb 62。在另一個實施方案中，所述藥物組合物包含本文描述 的單克隆抗體的抗原結合片段及藥物可接受的稀釋劑或運載體。在一些實施方案中，所述 抗原結合片段是鼠 mAb 11B9或mAb 62的抗原結合片段。在再一個實施方案中，所述藥物組 合物包含編碼所述抗體或抗體片段的核酸分子及藥物可接受的稀釋劑或運載體。在進一步 的實施方案中，所述藥物組合物包含具有所述核酸的載體及藥物可接受的稀釋劑或運載 體。在另一個實施方案中，所述藥物組合物包含表達所述載體的細胞及藥物可接受的稀釋 劑或運載體。在再一個實施方案中，所述藥物組合物包含編碼所述抗體或抗體片段的核酸 分子及藥物可接受的稀釋劑或運載體。在進一步的實施方案中，所述藥物組合物包含具有 所述核酸的載體及藥物可接受的稀釋劑或運載體。在另一個實施方案中，所述藥物組合物 包含表達所述載體的細胞及藥物可接受的稀釋劑或運載體。
[0018] 在一個實施方案中，本發明提供了一種減少對象中流感H7病毒感染或者降低對象 中流感H7病毒感染風險、抑制對象一或多種流感H7病毒毒株感染或者預防一或多種流感H7 病毒毒株所致流感感染或疾病的方法。在運個實施方案中，所述方法包括給有需要的對象 施用治療有效量的本文所述單克隆抗體或其抗原結合片段、包含編碼所述抗體或抗體片段 的多核巧酸的核酸分子、包含所述多核巧酸的載體或者表達所述載體的細胞。在一些實施 方案中，所述單克隆抗體是鼠 mAb 11B9或mAb 62。在一個實施方案中，所述對象是免疫功能 低下的，是嬰兒、幼兒或者老人。在另一個實施方案中，所述施用提供了治療益處。在再一個 實施方案中，所述治療益處包括抑制流感病毒滴度的增加、降低流感病毒滴度、抑制流感病 毒復制的增加、降低流感病毒復制、抑制流感病毒增殖的增加或者降低流感病毒的增殖，或 者降低對象中與流感病毒感染相關的一或多個癥狀或并發癥的進展、嚴重度、頻率、持續時 間或可能性。在一個實施方案中，所述癥狀或并發癥選自發冷、發熱、咳嗽、咽喉痛、鼻充血、 竇充血、鼻感染、竇感染、身體疼痛、頭痛、疲勞、肺炎、支氣管炎、耳感染、耳痛和死亡。在另 一個實施方案中，所述治療益處包括促進對象從流感H7病毒感染中康復。在進一步的實施 方案中，給對象施用的藥劑在對象感染流感H7病毒之前、基本同時或者之后施用。
[0019] 第Ξ方面，本發明提供了使用本文所述單克隆抗體或其片段鑒別、表征和/或定量 H7表達的方法和組合物。在一些實施方案中，所述單克隆抗體是鼠 mAb 11B9或mAb 62。在一 個實施方案中，所述H7表達設及H7流感病毒的HA的表達。在一個實施方案中，所述組合物包 含本文描述的單克隆抗體或其片段。在一些實施方案中，所述單克隆抗體是鼠 mAb 11B9或 mAb 62。在另一個實施方案中，所述方法包括檢測H7與本文描述的單克隆抗體或其片段的 結合。在一些實施方案中，所述單克隆抗體是鼠 mAbllB9或mAb 62。在一個實施方案中，本發 明設及利用運種結合蛋白的免疫巧光測定（IFA)、免疫組織化學測定及其它方法，包括 ELISA、血凝抑制化I)測定及病毒中和(VN)測定。在一個實施方案中，可W利用本文描述的 雙功能化ISA測定。
[0020] 在一些實施方案中，所述鑒別和/或定量H7表達的方法和組合物是用于鑒別和/或 定量疫苗中的H7病毒免疫原性物質。在一個實施方案中，所述免疫原性物質包含血凝素或 其抗原性部分，或者編碼血凝素或其抗原性部分的核酸。在另一個實施方案中，所述抗原性 部分包括血凝素的表位。在一個實施方案中，所述免疫原性物質是包含血凝素的病毒。在另 一個實施方案中，所述病毒是滅活的。在再一個實施方案中，所述病毒是減毒的病毒。在另 一個實施方案中，所述病毒是病毒體(virosome)形式。在進一步的實施方案中，所述病毒是 得自雞蛋或者得自細胞培養。在另一個實施方案中，所述免疫原性物質是包含血凝素的裂 解病毒(split virus)或者裂解病毒抗原性制備物。在一個實施方案中，所述免疫原性物質 是血凝素或其抗原性部分。在另一個實施方案中，所述血凝素或其抗原性部分已經被分離。 在再一個實施方案中，所述血凝素或其抗原性部分是由表達系統產生的。在一個實施方案 中，所述表達系統是任何表達系統，如病毒表達載體，其中所述血凝素或其抗原性部分呈現 或展示于病毒表面上。在一個實施方案中，所述病毒表達載體是任何表達載體，如修飾的痘 苗病毒表達載體、腺病毒表達載體、痘病毒表達載體、桿狀病毒表達載體等。在一個實施方 案中，所述表達載體是桿狀病毒表達載體，且呈現或展示血凝素或其抗原性部分的病毒是 桿狀病毒。在另一個實施方案中，所述免疫原性物質是編碼血凝素或其抗原性部分的核酸， 其能在對象中表達。
[0021] 第四方面，本發明提供了檢測生物樣品中甲型流感H7亞型病毒或者檢測生物樣品 中針對甲型流感H7血凝素的抗體(在本文稱作抗-H7抗體）的試劑盒和方法。在檢測生物樣 品中甲型流感H7亞型病毒的一個實施方案中，所述方法包括將樣品與第一抗體接觸，第一 抗體是如本文所述的單克隆抗體或其抗體片段(有時稱作捕獲抗體）。在另一個實施方案 中，所述方法進一步包括將樣品與如本文所述的特異性結合甲型流感H7亞型病毒的H7血凝 素表位的第二抗體或其抗體片段接觸，其中第二抗體含有或者與可檢測元件綴合(有時稱 作檢測抗體）。在檢測生物樣品中針對甲型流感H7血凝素的抗體的一個實施方案中，所述方 法包括將已經加入甲型流感H7亞型病毒的對照H7血凝素（在本文有時稱作對照H7抗原）的 樣品與第一抗體接觸，第一抗體是如本文所述的單克隆抗體或其抗體片段(有時稱作捕獲 抗體）。在另一個實施方案中，所述方法進一步包括將樣品與本文所述的特異性結合甲型流 感H7亞型病毒的H7血凝素表位的第二抗體或其抗體片段接觸，其中第二抗體含有或者與可 檢測元件綴合(有時稱作檢測抗體）。在一些實施方案中，第二抗體含有放射性原子，與巧光 分子綴合，或者與酶綴合。在其它實施方案中，第一抗體固定在固體表面上。在一些實施方 案中，第一單克隆抗體是鼠 mAb 11B9或mAb 62。在其它實施方案中，第二單克隆抗體是mAb 11B9或mAb 62。在一個實施方案中，對照H7抗原是重組H7抗原。在另一個實施方案中，對照 H7抗原是表面表達H7的病毒如桿狀病毒。在一個實施方案中，本發明設及利用運種單克隆 抗體或相關結合蛋白的免疫巧光測定（IFA)、免疫組織化學測定及其它方法，包括化ISA、血 凝抑制化I)測定和病毒中和(VN)測定。在一個實施方案中，可W利用如本文所述的雙功能 ELISA測定。
[0022] 在一個實施方案中，測定是雙功能化ISA，其對于H7禽流感病毒的抗原和抗體檢測 均有效。在一個實施方案中，mAb 11B9或mAb 62之一用作捕獲抗體，mAb 11B9或mAb 62的另 一種用作檢測抗體。在一個實施方案中，捕獲抗體包被在固相如微滴定板、微珠等上。為了 檢測生物樣品中的抗原，將樣品與捕獲抗體接觸足W使得樣品中的任何H7抗原與捕獲抗體 結合的一段時間。然后將檢測抗體與結合的樣品H7抗原(如果有的話)接觸足W使得檢測抗 體與所述結合的樣品H7抗原結合的一段時間。然后確定任何檢測抗體的結合，W確定樣品 中H7抗原的存在和/或量。為了檢測生物樣品中的抗-H7抗體，將對照H7抗原加入生物樣品 中W制備混合物。在一個實施方案中，將固定量的對照H7抗原加入生物樣品中。對照H7抗原 結合生物樣品中也許存在的任何抗-H7抗體。然后將混合物與捕獲抗體接觸足W使得對照 H7抗原結合捕獲抗體的一段時間。如果抗-H7抗體存在于生物樣品中，與捕獲抗體結合的對 照H7抗原中的一些將結合抗-H7抗體，且與捕獲抗體結合的對照H7抗原中的一些將游離于 結合的抗體。在一個實施方案中，對照H7抗原是重組H7抗原。在另一個實施方案中，對照H7 抗原是表面表達H7的病毒如桿狀病毒。然后將檢測抗體與不與樣品H7抗體(如果有的話)結 合的任何結合的對照H7抗原接觸一段時間，所述時間足W使得檢測抗體結合不與樣品H7抗 體結合的結合的對照H7抗原。然后確定檢測抗體的結合，W確定樣品中H7抗體的存在和/或 量。在一個實施方案中，結合的檢測抗體的水平降低表示生物樣品中存在抗-H7抗體。
[0023] 在一個實施方案中，所述試劑盒包含第一抗體及進行檢測甲型流感H7亞型病毒的 測定的說明書，所述第一抗體是本文描述的單克隆抗體或其抗體片段。在一些實施方案中， 所述單克隆抗體是鼠 mAb 11B9或mAb 62。在另一個實施方案中，所述試劑盒進一步包含特 異性結合甲型流感病毒的H7血凝素表位的第二抗體，其中第二抗體含有或者與可檢測元件 綴合。在一些實施方案中，第二抗體是mAb 11B9或mAb 62。在一些實施方案中，第二抗體含 有放射性原子，與巧光分子綴合，或者與酶綴合。在其它實施方案中，第一抗體固定在固體 表面上。在另一個實施方案中，試劑盒進一步包含H7血凝素抗原。在一些實施方案中，H7血 凝素抗原是重組H7蛋白。在其它實施方案中，H7血凝素抗原是表面表達H7的病毒如桿狀病 毒。在一個實施方案中，試劑盒可用于鑒別和/或定量疫苗中的H7病毒免疫原性物質。在另 一個實施方案中，試劑盒可用于檢測生物樣品中H7血凝素或者針對H7血凝素的抗體。在一 個實施方案中，本發明設及利用運種單克隆抗體或相關結合蛋白的免疫巧光測定(IFA)、免 疫組織化學測定及其它方法，包括化ISA、血凝抑制化I)測定和病毒中和(VN)測定。在一些 實施方案中，可利用本文所述雙功能化ISA測定。
[0024] 附圖簡述
[0025] 圖1A和1B示出mAb 11B9和62在小鼠中對抗H7N7的預防作用。圖1A:結果W存活百 分比表示。PBS用作陰性對照。圖1B:結果W體重百分比（在實驗開始時)表示。PBS用作陰性 對照。
[0026] 圖2A-2D示出在小鼠中mAb 62對抗H7攻擊的預防作用。圖2A和2B:小鼠組(η = 5)經 鼻內給予2.5mg/kg、5mg/kg、lOmg/kg或者0mg/kg(PBS)的mAb 62進行預處理。圖2C和2D:小 鼠組(n = 5)在經5MLD日日的小鼠適應的HPAI H7N7(A/Netherlands/219/03，RG)攻擊前一天經 腹膜內用5mg/kg、10mg/kg或0mg/kg(PBS)的mAb 62預處理。監測小鼠在14天觀測期的存活 及體重喪失情況。結果分別W存活百分比（圖2C和2D)和體重百分比（圖2A和2B)(在實驗開 始時)表示。
[0027] 圖3A和3B示出mAb 62在小鼠中針對H7攻擊的治療效力。小鼠組(η = 5)感染5MLD50 的小鼠適應的ΗΡΑΙ H7N7(A/Netherlands/219/03，RG)。在攻擊后一天，將小鼠通過腹膜內 途徑用15mg/kg的mAb 62或者通過鼻內途徑用5mg/kg、1 Omg/kg、15mg/kg或Omg/kg (PBS)的 mAb 62處理。監測在14天觀測期小鼠的存活和體重喪失情況。結果分別W存活百分比（圖 3B)和體重百分比（圖3A)(在實驗開始時)表示。
[0028] 圖4A和4B示出在小鼠中兩劑mAb 62針對H7攻擊的治療效力。小鼠組(η = 5)感染 10MLD50的小鼠適應的ΗΡΑΙ H7N7(A/Netherlands/219/03，RG)。在攻擊后 1 天、2天或7天，將 小鼠通過鼻內途徑用lOmg/kg或Omg/kg(PBS)的mAb 62處理一或兩次。監測14天觀測期小鼠 的存活及體重喪失情況。結果分別W存活百分比（圖4B)和體重百分比（圖4A)(在實驗開始 時)表示。Dpi:感染后天數。
[0029] 圖5A-祀示出在被動處理的小鼠中肺組織的組織病理學。在用5MLD50的HPAI H7N7 (A/Netherlands/219/03，RG)實驗性病毒感染后通過鼻內或腹膜內途徑用mAb 62(15mg/ kg)處理的小鼠的皿染色的肺切片的顯微照片。圖5A:在感染后14天收集的經鼻內途徑用 mAb 62處理的小鼠的肺切片。圖5B:在感染后14天收集的經腹膜內途徑用mAb 62處理的小 鼠的肺切片。圖5C:在感染后6天收集的未處理的感染小鼠的肺切片。圖5D:在感染后8天收 集的未處理的感染小鼠的肺切片。圖5E:未感染的小鼠的肺切片。
[0030] 圖6示出在被動處理的小鼠肺中病毒感染性滴度的測量。小鼠在用5MLD50的HPAI H7N7(A/Netherlands/219/03，RG)實驗性病毒感染之后用mAb 62(15mg/kg)通過鼻內或腹 膜內途徑處理。在感染后2、4、6和14天收集肺樣品。肺中荷載的病毒結果Wlogio