用硫酸鏈 霉素購于大連美羅大藥廠。
[0029]超凈工作臺、細胞培養箱(美國Thermo公司），4°C冰箱、_20°C冰箱（山東青島海爾 公司），-80°C冰箱(FormaScientific)，電熱鼓風干燥箱(天津實驗儀器廠），光學顯微鏡（日 本Olympus公司），倒置相差顯微鏡(德國Ieica公司），超速低溫離心機（日本日立公司），酶 標儀（上海科華生物工程股份有限公司），E-Centrifuge(Wealtec),微量加樣器（德國 Eppendorf)，電子恒溫水浴鍋(余姚市東方電工儀器廠），高壓滅菌鍋（山東新華醫療器械有 限公司），電子天平(上海天平儀器廠）。
[0030]二、試驗方法
[0031] I、細胞培養：
[0032] (1)常氧培養:將人胰腺癌MiaPaCa-2細胞放入5 % CO2、37°C、飽和濕度的CO2孵箱中 貼壁培養，適時換培養液，細胞貼壁生長融合至80 %~90 %時傳代。
[0033] (2)缺氧培養:將人胰腺癌MiaPaCa-2細胞放在5 % CO2、94 % N2、1 % O2、37°C、飽和濕 度的缺氧小室中培養。缺氧小室建立:缺氧裝置為可調式培養容器，有一進氣孔和一出氣 孔。實驗時，將缺氧培養的細胞放入可調式培養容器內，由進氣孔充入低氧混合氣體(5% C02+95 % N2+l % O2)，測得小室內氧氣濃度維持在1 %后密閉，移入細胞培養箱中，37°C培養。 每24h再沖氣和換氣一次后置37°C培養箱繼續培養，分別在24h、48h、72h后收集各組細胞， 用于MTT實驗。
[0034] 2、細胞增殖的檢測
[0035] (1)收集對數生長期MiaPaCa-2細胞，制備成單細胞懸液進行計數，調整濃度以每 孔5 X IO3個細胞接種96孔細胞培養板中，每孔總體積IOOyL(邊緣孔用同體積的無菌I3BS填 充），于5%C02、37°C、飽和濕度的CO2培養箱中培養，待細胞形成單層后棄上清給予不同濃度 化合物（I)處理。
[0036] (2)分空白對照組(不加藥物處理的等體積培養液)和化合物（I)藥物20ymol/L、40 4111〇1/1、8(^111〇1/1)，每組設6個平行孔，實驗重復三次，置入37°(3,5%0)2、94%吣、1%0 2的缺 氧小室中分別培養24h、48h、72h。
[0037] (3)用PBS輕輕沖洗96孔細胞培養板2次后，每孔加入IOyL MTT(5mg/mL)，繼續培養 4h后離心棄上清，每孔加入15yL的DMS0,放在搖床上振蕩15min，使結晶物充分溶解。
[0038] (4)酶聯免疫檢測儀于570nm處測量各孔的吸光度值(A值），計算細胞增殖抑制率。
[0039] (5)抑制率（％) =(空白對照組平均A值-藥物組平均A值)/空白對照組平均A值X 100%〇
[0040] (6)以濃度為橫軸，抑制率（％ )為縱軸繪制抑制率直方圖。
[0041 ] 3、統計學方法
[0042]采用SPSS 17.0進行數據處理，計量資料計量資料符合正態分布的，以均數士標準 差（i±s)表示，均數間比較采用單因素方差分析或t檢驗，以P〈0.05為差異有統計學意義。 [0043]三、結果及結論
[0044] MTT結果顯示：（1)化合物（I)干預人胰腺癌MiaPaCa-2細胞同等時間（24h、48h、 72h)時，隨著化合物（I)濃度(在實驗濃度范圍間內）的增加，其所對應的OD值越小，表明在 缺氧條件下化合物（I)對人胰腺癌MiaPaCa-2細胞干預時間相同時，隨著藥物濃度的增加， 細胞存活率降低。結果見表1(注: aP〈〇.〇l VS對照組;bP〈0.01 VS 20ymol/L組;。P〈0.01 VS 40ymol/L組）。
[0045] (2)不同濃度的（20ymol/L、40ymol/L、80ymol/L)化合物（I)干預人胰腺癌 MiaPaCa-2細胞48h后，不同濃度作用下細胞增殖抑制率分別為（20.13 ± 0.80) %、（ 34.83 土 0.66) %、（45.68± 1.45) %，抑制率隨藥物濃度增加呈上升趨勢，組間差異有統計學意義(P 〈0·05) JOymol/L的化合物（I)干預胰腺癌MiaPaCa-2細胞24h、48h、72h后，MiaPaCa-2細胞 生長抑制率分別為（38.78±0.92)%、（45.68±1.45)%、（55.95±2.20)%，呈時間依賴性 增高，組間差異有統計學意義(P〈〇.〇5)。結果見表2(注: aP〈0.01 VS對照組;bP〈0.01 VS 20μ πιο1/??_;Τ〈0·01 VS 40ymol/L組）。
[0046] 結論，化合物（I)對缺氧培養條件下人胰腺癌MiaPaCa-2細胞有明顯的增殖抑制作 用，隨著化合物（I)濃度的增加和作用時間的延長，抑制作用愈明顯，即在一定濃度范圍內 存在時間一一劑量依賴性。這可能成為胰腺癌治療的另一新思路。
[0047] 表1化合物（I)對人胰腺癌MiaPaCa-2細胞生長的影響(n = 6, i±S:)
[0051 ] 實施例3
[0052] 片劑的制備:按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒石酸、或檸檬 酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:7的 比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0053] 實施例4
[0054] 口服液的制備:按實施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有機酸如酒石酸、或檸 檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規口服液制法制成口 服液。
[0055] 實施例5
[0056] 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒 石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重 量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0057] 實施例6
[0058] 注射液的制備:按實施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有機酸如酒石酸、或檸 檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規加注射用水，精濾， 灌封滅菌制成注射液。
[0059] 實施例7
[0060] 無菌粉針的制備:按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒石酸、或 檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無菌注射用水 中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌熔封 得粉針劑。
[0061] 上述實施例的作用在于說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明的保護 范圍。本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發明技術方案的實質和保護范圍。
【主權項】
1. 具有下述結構式的化合物（I):2. 權利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于包含W下操作步驟：（a)將牛募 的干燥成熟果實粉碎，用70~80 %乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石 油酸、乙酸乙醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇 萃取物；（b)步驟(a)中正下醇取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個柱體積，再用 70%乙醇洗脫8個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b) 中70 %乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1、50:1、25:1、10:1和1:1的二 氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到5個組分；（d)步驟(C)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體 積比為15:1、10:1和5:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十 八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~ 12個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。3. 根據權利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于：步驟(a)中，用75%乙醇 熱回流提取，合并提取液。4. 根據權利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為D101型 大孔吸附樹脂。5. -種藥物組合物，其特征在于：其中含有治療有效量的權利要求1所述的化合物（I) 和藥學上可接受的載體。6. 權利要求1所述的化合物（I)在制備治療膜腺癌的藥物中的應用。7. 權利要求5所述的藥物組合物在制備治療膜腺癌的藥物中的應用。
【專利摘要】本發明公開了用于治療胰腺癌的生物堿化合物及其制備方法，屬于藥物技術領域。該化合物為首次報道，是一種結構新穎的生物堿類化合物，可以從牛蒡的干燥成熟果實中提取、分離純化得到。體外試驗證實該化合物對缺氧培養條件下人胰腺癌MiaPaCa-2細胞有明顯的增殖抑制作用，隨著化合物(Ⅰ)濃度的增加和作用時間的延長，抑制作用愈明顯，即在一定濃度范圍內存在時間——劑量依賴性，可以用來開發成治療胰腺癌的藥物。
【IPC分類】A61P1/18, A61P35/00, A61K31/439, C07D471/20
【公開號】CN105541842
【申請號】CN201511026559
【發明人】吳金鳳
【申請人】吳金鳳
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2015年12月31日