X 1012終產物。
[0120] 對比例一：
[0121]將解淀粉芽孢桿菌HC200無菌劃線接種于滅菌的固體培養基上（固體培養基按質 量百分比，由如下組分組成：牛肉膏0.3%、蛋白胨0.6%、瓊脂1.5%，余量為水，PH7.0,121 °C、0 · 1 IMpa滅菌20min ·)37°C培養4天。
[0122] 將固體培養基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后，接種于1000ml搖瓶的滅菌培養基 中（培養基按質量百分比：由如下組分組成:葡萄糖0.4%、牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、酵母 膏0.5 %、磷酸氫二鉀0.1 %、硫酸銨0.2 %、氯化鈉0.5 %，消泡劑0.15 %、余量為水，PH7.0， 121°(3、0.1謂?&滅菌201^11)，培養基裝量為2001111，搖床培養條件為 :溫度37°(3、轉數220印111， 培養16小時。
[0123] 將步驟得到的種子液接種于100L種子發酵罐的滅菌培養基中（培養基按質量百分 比：由如下組分組成:葡萄糖0.4%、牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、酵母膏0.5%、磷酸氫二鉀 0.1 %、硫酸銨0.2 %、硫酸鎂0.02 %、硫酸錳0.005 %、氯化鈉0.5 %，消泡劑0.15 %、余量為 水，PH 7.0，121°(3、0.1說?&滅菌2〇1^11)，培養基裝量為7(^，接菌量5%(￥八），發酵條件為 ： 溫度37°C、罐壓0.05Mpa，通氣比列：起始通氣比為l:0.6(v/v)，發酵6小時后加大通氣比為 1: l(v/v)、起始攪拌轉數為180rpm，發酵6小時后攪拌轉數調整為220rpm，發酵培養10小時， 得到二級罐所用種子菌液；
[0124] 將步驟培養的種子液接種于1000L發酵罐的滅菌培養基中（培養基按質量百分比： 由如下組分組成：葡萄糖0.4 %、玉米漿粉2 %、玉米微粉0.1 %，磷酸氫二鉀0.1 %、硫酸銨 0 · 2 %、硫酸鎂0 · 01 %、氯化鈉0 · 2 %、消泡劑0 · 15 %、余量為水，PH7 · 0，121 °C、0 · 1 IMpa滅菌 20-30min)，培養基裝量為700L，發酵條件為:溫度37°C、罐壓0.05Mpa，通氣比列:起始通氣 比為1 :〇.6(v/v)，發酵6小時后加大通氣比為1: l(v/v)、起始攪拌轉數為180rpm，發酵6小時 后攪拌轉數調整為220rpm，接種量10% (v/v)，發酵培養36小時。收集發酵培養液得到芽孢 桿菌液體產品。營養瓊脂平板計數活菌數9.6 X 109cfu/ml，芽孢率75 %。
[0125] 將實施例一至三、對比例的實驗條件和結果匯總，如表1。
[0126] 表1
[0127]
[0128] 實施例五：
[0129] 實施例五和實施例一的區別在于：將解淀粉芽胞桿菌（B a c i 1 1 u s amyloliquefaciens)H5取代解淀粉芽孢桿菌HC200進行發酵生產。
[0130] 實施例六：
[0131 ]實施例六和實施例二的區別在于：將解淀粉芽胞桿菌（B a c i 1 1 u s amyloliquefaciens)H5取代解淀粉芽孢桿菌HC200進行發酵生產。
[0132] 實施例六：
[0133] 實施例七和實施例三的區別在于：將解淀粉芽胞桿菌（B a c i 1 1 u s amyloliquefaciens)H5取代解淀粉芽孢桿菌HC200進行發酵生產。
[0134] 實施例八：
[0135] 實施例八和實施例四的區別在于：將解淀粉芽胞桿菌（B a c i 1 1 u s amyloliquefaciens)H5取代解淀粉芽孢桿菌HC200進行發酵生產。
[0136] 對比例二：
[0137] 對比例二和對比例一的區別在于：將解淀粉芽胞桿菌（B a c i 1 1 u s amyloliquefaciens)H5取代解淀粉芽孢桿菌HC200進行發酵生產。
[0138] 將實施例五至八、對比例二的實驗條件和結果匯總，如表2。
[0139] 表2
[0140]
[0142] 從以上實驗結果來看，液體發酵條件和半固體發酵條件對解淀粉芽胞桿菌的產率 和芽孢率影響很大，尤其是半固體培養基營養成分和水的比例、接種量和發酵溫度等。通過 本發明將由液體和半固體發酵工藝結合及其工藝參數優化，獲得的解淀粉芽孢桿菌終產物 菌體含量為3.21 X 1012cfu/g、芽孢率高達93%。
[0143] 采用本發明提供了一種由液體和半固體發酵工藝結合高密度生產解淀粉芽孢桿 菌的方法，該方法將液體發酵生產與半固體發酵生產相結合，先利用液體培養快速生長的 芽孢菌體，然后轉接到含有椰糠粉和木薯渣粉的半固體營養基質上產生大量芽孢，從而提 高產率，避免前期污染。
[0144] 本發明提供的方法，生產工藝簡單，顯著提高芽孢產量，減少了培養過程中的污染 機率，而且不需要復雜設備。
[0145] 本發明提供的方法中，本發明提供的方法中，培養基的原料主要為熱帶特有加工 副廣品和常見的農副廣品。挪糖粉和木署渣粉是熱帶地區所特有的加工副廣物，挪糖粉是 椰子外殼的纖維粉末，是從椰子外殼纖維加工過程中脫落下的一種可以天然降解、純天然 的有機質媒介。椰糠粉在半固體發酵起到良好通氣性、保水性并且能提供微生物發酵所需 的微量元素。木薯渣粉是木薯提取淀粉后的副產物，主要指標包括粗纖維、少量淀粉和粗蛋 白，木薯渣粉含有豐富的礦物質(包括氮、磷、鉀、碳、鈣、鎂、硫、鋅、錳、銅、鐵和鈉）。米粉、玉 米粉來源廣泛、充足，成本低廉，易調控，成功率高。
[0146] 綜上所述，本發明提供的解淀粉芽胞桿菌的生產方法，生產工藝經濟實用、生產效 率高、投資少、占地小、生產可以實現規模化且無三廢問題，適于大量推廣應用，將產生巨大 的經濟效益。
[0147] 以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精 神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明保護的范圍之內。
【主權項】
1. 一種由液體和半固體發酵工藝結合高密度生產解淀粉芽孢桿菌的方法，其特征在 于，包括以下步驟： ① 液體發酵 將解淀粉芽孢桿菌的種子液接種至液體發酵培養基，接種量為1-5%，在溫度為35-38 °C，通入空氣量為25-35L/min，壓力為0.02-0.04Mpa的條件下培養20-26h后獲得液體發酵 產物； 所述液體發酵培養基包括18-228/1蔗糖、8-128/1豆柏粉、0.8-1.28/1酵母粉、1.0- 1.4g/LK2HP〇4P0.8-1.2g/LMgCL2; ② 半固體發酵 將液體發酵產物接種至半固體發酵培養基并混合均勻，接種量為18-22%，在溫度為 35-38°C、濕度為50-70 %的條件下培養4-6天，獲得半固體發酵產物； 所述半固體培養基按重量份計，包括80-100份玉米粉、8-12份大米粉、35-50份椰糠粉、 14-17份木薯渣粉和160-200份水。2. 根據權利要求1所述的一種由液體和半固體發酵工藝結合高密度發酵生產解淀粉芽 孢桿菌的方法，其特征在于，所述解淀粉芽孢桿菌的種子液濃度為1.2 X101()-5.6 X 1010cfu/mL〇3. 根據權利要求2所述的一種由液體和半固體發酵工藝結合高密度發酵生產解淀粉芽 孢桿菌的方法，其特征在于，包括以下步驟： ① 液體發酵 將解淀粉芽孢桿菌的種子液接種至液體發酵培養基，接種量為3 %，在溫度為37°C，通 入空氣量為30L/min，壓力為0.03Mpa的條件下培養24h后獲得液體發酵產物； 所述解淀粉芽孢桿菌的種子液濃度為4.0X101()CfU/mL; 所述液體發酵培養基包括20g/L蔗糖、10g/L豆柏粉、1. Og/1酵母粉、1.2g/L K2HP〇4和 1.Og/L MgCL2 ； ② 半固體發酵 將液體發酵產物接種至半固體發酵培養基并混合均勻，接種量為20 %，后在溫度為37 °C、濕度為60 %的條件下培養5天，獲得半固體發酵產物； 所述半固體培養基按重量份計，包括90份玉米粉、10份大米粉、40份椰糠粉、15份木薯 渣粉和200份水。4. 根據權利要求1-3任一項所述的一種由液體和半固體發酵工藝結合高密度發酵生產 解淀粉芽孢桿菌的方法，其特征在于，所述解淀粉芽孢桿菌的種子液由以下方法培養獲得： 將解淀粉芽孢桿菌接種于LB培養基培養32h-48h，后接種至液體種子培養基培養獲得種子 液，所述液體種子培養基包括蔗糖20g/L、酵母粉10g/L、K 2HP〇4 1.2g/L、MgCL2 1. Og/L和消 泡劑0.2mL。5. 根據權利要求1-3任一項所述的一種由液體和半固體發酵工藝結合高密度生產解淀 粉芽孢桿菌的方法，其特征在于，還包括將半固體發酵產物在發酵室里干燥并粉碎，得到終 產物。
【專利摘要】本發明公開了一種由液體和半固體發酵工藝結合高密度生產解淀粉芽孢桿菌的方法，包括液體發酵：將解淀粉芽孢桿菌的種子液接種至液體發酵培養基，接種量為1-5％，在溫度為35-38℃，通入空氣量為25-35L/min，壓力為0.02-0.04Mpa的條件下培養20-26h后獲得液體發酵產物；半固體發酵：將液體發酵產物接種至含有椰糠粉和木薯渣粉的半固體發酵培養基并混合均勻，接種量為18-22％，在溫度為35-38℃、濕度為50-70％的條件下培養4-6天，獲得半固體發酵產物；通過本發明將由液體和半固體發酵工藝結合及其工藝參數優化，獲得的解淀粉芽孢桿菌終產物菌體含量為3.21×1012cfu/g、芽孢率高達93％。
【IPC分類】A01P3/00, C12R1/07, C12N1/20
【公開號】CN105524863
【申請號】CN201511029006
【發明人】黃俊生, 梁昌聰, 劉磊, 汪軍, 張建華, 王偉偉, 楊臘英, 郭立佳, 王國芬, 丁兆建
【申請人】中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2015年12月31日