一種由液體和半固體發酵工藝結合高密度生產解淀粉芽孢桿菌的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物發酵領域，尤其涉及一種由液體和半固體發酵工藝結合高密度 生產解淀粉芽孢桿菌的方法。
【背景技術】
[0002] 解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一種具有廣譜抑菌活性的細 菌，具有較強的次生代謝產物產生能力，能抑制尖孢鐮刀菌等多種植物病原真菌。
[0003] 目前國內外對解淀粉芽孢桿菌發酵的優化主要集中在產抗菌脂肽、α-淀粉酶、蛋 白酶等酶類物質，較少研究解淀粉芽孢桿菌數量發酵工藝優化;而在此類菌數量發酵優化 研究中，多數研究的目標在解淀粉芽孢桿菌液體深層發酵技術，對解淀粉芽孢桿菌高密度 發酵工藝技術的研究較少。但從微生物菌劑的產業化和規模化，半固體發酵技術在生產上 更具實際意義。
[0004] 當前，芽孢桿菌產品的工業化生產方式主要分為液體深層發酵和固體發酵，液態 深層發酵優點是發酵過程易于控制，自動化程度高，產品純度高，但對設備要求高，投資較 大，耗能高，環境污染嚴重并且發酵后需要吸附干燥，工藝程序多；固體發酵其優點是發酵 產量高且發酵后不需要吸附，直接烘干粉碎即可使用，工藝簡單，生產成本低，缺點是發酵 過程不易于控制，雜菌污染不易控制。半固體發酵是固體發酵的一種類型，是指在培養基呈 固態，雖然含水豐富，但在沒有或基本沒有自由流動水的狀態下進行的一種微生物發酵過 程。
[0005] 其中中國專利ZL201110428027.7公開了一種畜禽用凝結芽孢桿菌高密度發酵方 法及其制備的制劑和應用，首先對凝結芽孢桿菌進行液體發酵，然后進行固體變溫連續發 酵，固體發酵后期進行通風，繼續發酵兼干燥，干燥結束，獲得凝結芽孢桿菌制劑初產品，經 進一步粉碎過篩，獲得高密度凝結芽孢桿菌菌劑終產品，終產品菌體數可達115.5 X 108cfu. g-Ι，芽孢率可達77.2 %。但存在終產品菌體量較低、芽孢率低等問題。
【發明內容】
[0006] 有鑒于此，本發明提供了一種由液體和半固體發酵工藝結合高密度生產解淀粉芽 孢桿菌的方法，解決了工業化生產解淀粉芽孢桿菌存在的菌體量和芽孢率低的問題。
[0007] 本發明采用的技術手段如下:一種由液體和半固體發酵工藝結合高密度發酵生產 解淀粉芽孢桿菌的方法，包括以下步驟：
[0008] ①液體發酵
[0009] 將解淀粉芽孢桿菌的種子液接種至液體發酵培養基，接種量為1-5%，在溫度為 35-38°C，通入空氣量為25-35L/min，壓力為0.02-0.04Mpa的條件下培養20-26h后獲得液體 發酵產物；
[0010]液體發酵培養基包括18-22g/L蔗糖、8-12g/L豆柏粉、0 · 8-1 · 2g/L酵母粉、1 · 0- 1.4g/LK2HP〇4P0.8-1.2g/LMgCL2;
[0011] ②半固體發酵
[0012] 將液體發酵產物接種至半固體發酵培養基并混合均勻，接種量為18-22 %，在溫度 為35-38°C、濕度為50-70 %的條件下培養4-6天，獲得半固體發酵產物；
[0013] 半固體培養基按重量份計，包括80-100份玉米粉、8-12份大米粉、35-50份椰糠粉、 14-17份木薯渣粉和160-200份水。
[0014]優選地，解淀粉芽孢桿菌的種子液濃度為1.2X 101Q-5.6X 101Qcfu/mL。
[0015] 優選地，一種由液體和半固體發酵工藝結合高密度發酵生產解淀粉芽孢桿菌的方 法，包括以下步驟：
[0016] ①液體發酵
[0017] 將解淀粉芽孢桿菌的種子液接種至液體發酵培養基，接種量為3%，在溫度為37 °C，通入空氣量為30L/min，壓力為0.03Mpa的條件下培養24h后獲得液體發酵產物；
[0018]解淀粉芽孢桿菌的種子液包括濃度為4.0 X 101()cfu/mL解淀粉芽孢桿菌；
[0019]液體發酵培養基包括20g/L鹿糖、10g/L豆柏粉、1. Og/L酵母粉、1.2g/LK2HP〇4和 1.Og/L MgCL2 ；
[0020] ②半固體發酵
[0021] 將液體發酵產物接種至半固體發酵培養基并混合均勻，接種量為20%，后在溫度 為37°C、濕度為60 %的條件下培養5天，獲得半固體發酵產物；
[0022]半固體培養基按重量份計，包括90份玉米粉、10份大米粉、40份椰糠粉、15份木薯 渣粉和200份水。
[0023] 優選地，解淀粉芽孢桿菌的種子液由以下方法培養獲得:將解淀粉芽孢桿菌接種 于LB培養基培養32h_48h，后接種至液體種子培養基培養獲得種子液，所述液體種子培養基 包括蔗糖20g/L、酵母粉 10g/L、K2HP〇4l · 2g/L、MgCL2l · Og/L和消泡劑0 · 2mL。
[0024] 通過本發明將由液體和半固體發酵工藝結合及其工藝參數優化，獲得的解淀粉芽 孢桿菌終產物菌體含量為3.21 X 1012cfu/g、芽孢率高達93%。
[0025] 本發明提供了一種由液體和半固體發酵工藝結合高密度生產解淀粉芽孢桿菌的 方法，該方法將液體發酵生產與半固體發酵生產相結合，先利用液體培養快速生長的芽孢 菌體，然后轉接到含有椰糠粉和木薯渣粉的半固體營養基質上產生大量芽孢，從而在提高 菌體產率和芽孢率的基礎上，大批量生產。
[0026]進一步地，本發明提供的方法，生產工藝簡單，顯著提高芽孢產量，減少了培養過 程中的污染機率，而且不需要復雜設備。
[0027] 本發明提供的方法中，培養基的原料主要為熱帶特有加工副產品和常見的農副產 品。椰糠粉和木薯渣粉是熱帶地區所特有的加工副產物，椰糠粉是椰子外殼的纖維粉末，是 從椰子外殼纖維加工過程中脫落下的一種可以天然降解、純天然的有機質媒介。椰糠粉在 半固體發酵起到良好通氣性、保水性并且能提供微生物發酵所需的微量元素。木薯渣粉是 木薯提取淀粉后的副產物，主要指標包括粗纖維、少量淀粉和粗蛋白，木薯渣粉含有豐富的 礦物質(包括氮、磷、鉀、碳、鈣、鎂、硫、鋅、錳、銅、鐵和鈉）。米粉、玉米粉來源廣泛、充足，成 本低廉，易調控，成功率高。
[0028] 綜上所述，本發明提供的解淀粉芽胞桿菌的培養方法，生產工藝經濟實用、生產效 率高、投資少、占地小、生產可以實現規模化且無三廢問題，適于大量推廣應用，將產生巨大 的經濟效益。
【具體實施方式】
[0029]以下對本發明的原理和特征進行描述，所舉實施例只用于解釋本發明，并非用于 限定本發明的范圍。
[0030] 本發明選用的解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)HC200,其在中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. 10371，該菌株在 申請專利CN201510653843.6公開。解淀粉芽胞桿菌（Bacillus &11171〇1丨9116€&(^6118)!15，其 保藏于中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所。
[0031]本發明生產出的解淀粉芽胞桿菌發酵物干燥成粉劑可直接用于防控香蕉枯萎病， 番茄青枯病，甜瓜枯萎病，馬鈴薯疫病，蘋果紅腐病，黑星病等土傳病害和芒果炭疽病、甜瓜 白粉病、葡萄白粉病等地上病害。
[0032] 實施例一：
[0033] 解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)HC200的生產方法包括以下步 驟：
[0034] 1、菌種培養
[0035]將解淀粉芽孢桿菌HC200接種于LB培養基平板，在37°C培養32h直至菌體長滿平 板。
[0036] LB培養基:胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、瓊脂17g，用水定容至1000ml， pH為7.0。
[0037] 2、液體種子培養
[0038]在1000ml三角瓶中裝入400ml液體種子培養基，然后接種步驟1培養得到的菌種， 接種量為每個三角瓶接種1/6的培養皿平板菌種（培養皿規格為90mm)，37°C、180rpm培養 24h，得到種子液，種子液中的菌濃度為1.2 X 101Qcfu/mL。
[0039] 液體種子培養基:取蔗糖20g、酵母粉10g、K2HP〇4l.2g和MgCL2lg，溶于水并用水定 容至1000mL ;pH=6.5;121°C高壓滅菌20分鐘，冷卻至40°C后用于接種。
[0040] 3、液體發酵生產
[0041] 在100升機械攪拌發酵罐中裝入60升液體發酵培養基，然后接種步驟2得到的種子 液，接種量為1% (即每1份體積種子液接種至99份體積液體發酵培養基）。
[0042] 培養條件:35°C，通入空氣且通氣量為25L/min，保壓0.02Mpa，培養20h。
[0043]完成上述培養后，將發酵罐內的所有物質作為液體發酵產物。
[0044]通過顯微鏡觀察到液體發酵產物中出現大量芽孢菌體，發酵液渾濁。
[0045]液體發酵培養基:取蔗糖18g、豆柏粉12g、酵母粉0.8g、K2HP〇4l. 0g和MgCL20.8g，消 泡劑0.2ml，溶于水并用水定容至1000mL;pH=6.5; 121°C高壓滅菌20分鐘，冷卻至40°C后用 于接種。
[0046] 4、半固體發酵生產
[0047]培養架:腔內具有尼龍紗網隔層的四立柱架子，長3.2m、寬0.7m、高2.6m，用不漏水 尼龍紗網隔成7層結構，層間距30cm，四立柱材質是碳鋼噴塑。
[0048] 半固體發酵培養基按重量份數計:將100份玉米粉、8份大米粉、50質量份椰糠粉、 14質量份木薯渣粉和170份水混合均勻；自然pH;在121°C蒸汽滅菌60分鐘。
[0049] 在經甲醛和高錳酸鉀薰蒸滅菌的發酵室內，將液體發酵產物接種至半固體發酵培 養基并混合均勻，接種量為18% (即18體積份液體發酵產物接種至82體積份半固體發酵培 養基），然后將混合物置于發酵室內的培養架的尼龍紗