asnC的陽性率為82% W上；在非致 肝脈腫肺炎克雷伯菌中，3個基因的檢出率全為0%，結果說明運3個基因都具有很高的特異 性，可W作為診斷肺炎克雷伯菌肝脈腫的分子標志物。此發現為臨床醫生和實驗室人員診 斷肺炎克雷伯菌肝脈腫提供依據，特別是在血液等其他體液來源標本的培養結果正式報告 前，利用患者血液標本或肝臟脈腔脈液，采用快速的PCR方法檢測致肝脈腫肺炎克雷伯菌特 異性基因 sdm、lak和asnC的有無，結合患者臨床表現和影像學資料，可從陜速對肺炎克雷伯 菌肝脈腫做出診斷，提高肺炎克雷伯菌肝脈腫的治療成功率。
【附圖說明】
[0024] 圖1為邸-1^\699、邸-1^\801和邸-]\?)1?800單菌落0魁瓊脂糖凝膠電泳檢測送測基因 組的質量。
[0025] 其中 CH-LA699,泳道 1 ;CH-LA801，泳道 2;CH-MDR800,泳道 3。
[0026] 圖2為S血在臨床分離的致肝脈腫和非致肝脈腫肺炎克雷伯菌中特異性擴增結果。
[0027] 其中泳道1-17為致肝脈腫肺炎克雷伯菌，其目的產物長度為317bp; 18-34號為非 致肝脈腫肺炎克雷伯菌。
[0028] 圖3為lak在臨床分離的致肝脈腫和非致肝脈腫肺炎克雷伯菌中特異性擴增結果。
[0029] 其中泳道1-17為致肝脈腫肺炎克雷伯菌，其目的產物長度為219bp; 18-34號為非 致肝脈腫肺炎克雷伯菌。
[0030] 圖4為asnC在臨床分離的致肝脈腫和非致肝脈腫肺炎克雷伯菌中特異性擴增結 果。
[0031] 其中泳道1-17為致肝脈腫肺炎克雷伯菌，其目的產物長度為27化p; 18-34號為非 致肝脈腫肺炎克雷伯菌。
【具體實施方式】
[0032] 具體實施例對本發明作進一步說明。本發明所述技術方案，如未特別說明，均為本 領域的常規方案。
[0033] 實施例1:
[0034] 特異性基因序列的篩選過程結合第二代測序技術（Next-Generation Sequencing，NGS)，比較基因組學（Comparative Genomics)及生物信息學 (Bioinformatics)方法，并采用科學的統計學方法，對序列在多個肺炎克雷伯菌基因組中 分布的特異性進行檢驗，并且在分離的致肝脈腫肺炎克雷伯菌及非致肝脈腫肺炎克雷伯菌 中進行PC閲金證，W確定序列在致肝脈腫肺炎克雷伯菌中的特異性。具體實施過程如下：
[0035] 病原菌分離與鑒定：
[0036] 1.可疑肺炎克雷伯菌肝脈腫患者的入選。根據W下條件篩選臨床可疑肺炎克雷伯 菌肝脈腫患者：
[0037] (1)患者的臨床表現:發熱、寒戰和腹痛；
[0038] (2)實驗室檢查指標變化：白細胞升高、中性粒細胞比例升高、C反應蛋白升高、肝 功能異常；
[0039] (3)影像學檢查結果:肝臟有脈腔占位；
[0040] (4)血培養結果為肺炎克雷伯菌。
[0041] 因為肺炎克雷伯菌肝脈腫患者的臨床表現和實驗室指標變化不是很典型，所W單 獨滿足條件(3)或滿足條件(3) + (4)的患者也被入選。
[0042] 2.脈液的穿刺、細菌的培養和鑒定。上面入選的患者，將在CT引導下經皮穿刺抽吸 脈液，在無菌條件下，用接種環挑取脈液，四區劃線接種于血平板，37°C培養箱中過夜培養。 挑取平板上的單菌落增菌培養后，用生理鹽水稀釋成0.5個麥氏濁度，用生物梅里埃公司的 全自動細菌鑒定系統鑒定菌種。如鑒定結果為肺炎克雷伯菌，則患者可W確診為肺炎克雷 伯菌肝脈腫，保存菌種用于后續研究。
[0043] 全基因組測序：
[0044] 1.菌株選取。共分離培養獲得17株致肝脈腫肺炎克雷伯菌，選取其中2株(分別命 名為K.pneumoniae subsp.pneumonia CH-LA699和Κ.pneumoniae subsp.pneumonia CH-LA801)和1株非致肝脈腫肺炎克雷伯菌（命名為K.pneumonia subsp.pneumonia CH-MDR800)用于基因組測序。1株非致肝脈腫肺炎克雷伯菌隨機選自非肝脈腫患者血中分離的 肺炎克雷伯困。
[0045] 2.基因組抽提和建庫。分別挑選CH-LA699XH-LA801和CH-MDR800的單菌落，接種 于2ml的LB肉湯培養基中，37°C，150轉/分，搖菌過夜。吸取過夜菌30ul至Ij3ml的新鮮LB肉湯 培養基中，37°C，150轉/分，搖菌3小時。用天根細菌基因組DNA提取試劑盒(DP30 2)提取總 DNA，操作步驟參照說明書。將提好的DNA用天根RNA酶(RT405-12)處理，去除污染的RNA，操 作步驟參照說明書。最后DNA經DNA瓊脂糖凝膠電泳檢驗合格送測（圖1)。
[0046] 3.111皿ina Miseq平臺測序。提好的基因組，送到上海昂樸生物科技有限公司，采 用Illumina Miseq平臺進行測序。
[0047]生物信息學和比較基因組分析：
[004引1.基因組拼接。使用SPAdes(v3.5)軟件對測序產生的讀段序列進行拼接，拼接后 產生較長的基因組(Scaffolds)序列用于后續基因組分析；
[0049] 2.基因預測與注釋。使用PATRIC在線分析平臺對基因組序列進行基因預測，使用 多個已知基因功能的數據庫對預測出的基因進行功能注釋及蛋白質家族注釋；
[0050] 3.蛋白質家族比較分析。使用PATRIC在線分析平臺的蛋白質家族比較分析功能對 3株本發明中測序的肺炎克雷伯菌及另外3株化.pneumoniasubsp. F*neumonia NTUH-K2044 致肝脈腫，Κ . pneumonia subsp .化eumonia HSl 1286非致肝脈腫和Κ . pneumonia subsp.pneumonia MG冊7578非致肝脈腫）美國國立生物信息中屯、（化tional Center for Biotechnology Info;rmation，NCBI)公共數據庫中公布的遺傳背景和致病性明確的肺炎克 雷伯菌基因組上所有基因進行比較分析。篩選的基因序列需滿足如下要求：1)只在致肝脈 腫的肺炎克雷伯菌基因組中存在，即只存在于CH-LA699，CH-LA801和NTUH-K2044菌株的基 因組中；2)基因功能清楚或比較清楚，即被PATRIC蛋白質家族數據庫所注釋;根據W上方法 篩選得到48個基因滿足要求。
[0051] 4.檢驗篩選的蛋白質家族代表序列在網絡公布的肺炎克雷伯菌基因組中的特異 性。根據Sanger中屯、2015年發表的關于肺炎克雷伯菌基因組結構和全球肺炎克雷伯菌分布 的文章(PMID:26100894)，篩選54株分離部位、遺傳背景和致病性較明確的菌株，其中8株為 分離自肝脈腫的肺炎克雷伯菌。WNTUH-K2044基因組中的序列為蛋白質家族的基因代表序 列，使用bwa(v 0.7.12)將54株肺炎克雷伯菌的基因組原始讀段比對到基因代表序列上，使 用samtools(vl.2)統計序列比對結果。如果比對到基因代表序列上的所有讀段總長度大于 或等于該基因的長度，則認為該基因組中包含運個蛋白質家族，否則認為，該基因組中不包 含該蛋白質家族。具體按如下公式進行運算：
[0化2]
[005引其中El功0-1二元變量，指示i基因是否在j基因組中存在;N為比對至Iji基因上的讀 段總數;1為讀段平均長度(bp) ;L為i基因的長度(bp);在本發明中，得到48X54矩陣。
[0054] 統計學分析：
[0055] 1. 2X2聯表構建。對W上比對獲得的iXj矩陣進行處理，根據致肝脈腫-非致肝 脈腫，包含i蛋白質家族-不包含i蛋白質家族，將矩陣劃分成i個2X2聯表。共得到48個2X2 聯表。
[0化6] 2 .Fisher精確檢驗和多重P值矯正。使用R(v 3.2.2)對i個2 X 2聯表分別進行 Fisher精確檢驗，使用抑R算法對i個P值進行多重矯正，矯正后P值小于0.05的基因被認為 在肝脈腫中特異性存在基因。經過與臨床微生物學家討論后，認為其中sdm(SEQ ID NO.1所 示）、13^569 10^.3所示)和33此(569 10^.2所示）（表1)與肝脈腫相關性較高，可作為 肝脈腫的風險因子用于臨床檢測。
[0057]表1.本發明篩選得到的致肝脈腫肺炎克雷伯菌特異性基因 Fisher精確檢驗結果
[0化引
[0化9] 沖值小于0.05，統計結果差異顯著
[0060] 實施例2:
[0061 ] 基因特異性驗證：
[0062] Ξ個致肝脈腫肺炎克雷伯菌特異性基因在臨床分離菌株中的驗證，其具體步驟 是：
[0063] 1.選擇臨床分離的致肝脈腫和非致肝脈腫肺炎克雷伯菌菌株，用于檢測sdm(SEQ 10^.1所示）、134(569 10^.3所示)和3311(：(569 10^).2所示)在致肝脈腫肺炎克雷伯 菌中的特異性。選擇肝脈腫患者脈腔中分離的17株肺炎克雷伯菌作為檢測組（致肝脈腫 組），另選取非肺炎克雷伯菌肝脈腫患者中分離的肺炎克雷伯菌17株作為陰性對照組(非致 肝脈腫組）。同時也選取了臨床上分離的常見其他致病菌(其他致病菌組）W進一步驗證運 些因子在致肝脈腫肺炎克雷伯菌中的特異性:包括金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、鮑曼不動 桿菌、尿腸球菌、糞腸球菌。
[0064] 2. 3個預測基因特異性引物的設計:針對sdm、lak和asnC特異性序列設計的引物 如下：
[0065] S血的引物為：
[0066] sdm_F：TTGAATCTTACCCAGAGGAACTT
[0067] sdm_R：AACAGCACCTTTCACAACGACAT [006引 lak的引物為：
[0069] lak_F:TATCCGCTCAGACAACGACAT