致肝膿腫肺炎克雷伯菌特異性基因序列asnC及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及醫學疾病診斷和治療藥物選擇領域，具體設及致肝脈腫肺炎克雷伯菌 基因特異性序列asnC及其應用。
【背景技術】
[0002] 肺炎克雷伯菌化.pneumoniae subsp.pneumonia)，屬于腸桿菌科細菌，革蘭染色 陰性，有較厚的芙膜，多數有菌毛，無芽抱和鞭毛，寄生于人體皮膚、鼻咽部和腸道等處，可 引起嚴重的肺炎、尿路感染和血流感染等，是臨床上常見的條件致病菌化i B，Zhao Y，Liu C,Chen Z,Zhou D.Molecular pathogenesis of Klebsiella pneumoniae .Future Microbiol，201 4;9(9):1071-81)。
[0003] 肝脈腫化iver Abscess, LA)是發生于肝臟的一種繼發性感染性疾病，可W由細 菌、真菌、寄生蟲等引起，感染病變中屯、液化壞死、組織溶解、肉芽組織覆蓋并形成脈腔，是 常見的消化系統嚴重疾病。20世紀70年代W前，細菌性肝脈腫主要由W大腸埃希菌為主，當 時非手術治療肝脈腫的死亡率高達83%，手術治療的死亡率高達28%，促成高死亡率的主 要原因是診斷和治療的不及時（Valles J,C.Leon , Alvar ez-Lerma .Nosocomial bacteremia in critically ill patients: a multi-center study evaluating epidemiology and prognosis.Clin Infe ct Dis,1997,24:387-395)。1986年，臺灣Liu等 人首次報道了由肺炎克雷伯菌導致的肝脈腫病例7例化iu Υ，化eng D，Lin C.Klebsiella pneumoniae liver abscess associated with septic endophthalmitis.Arch Intern Med 1986; 146:1913-16)。隨后肺炎克雷伯菌肝脈腫在東亞地區開始流行，包括：中國、新加 坡、香港、韓國和越南等。1999年，美國出現肺炎克雷伯菌肝脈腫病例并開始流行(Saccente Μ.Klebsiella pneumoniae liver abscess,endoph thalmitis,and meningitis in a man with newly recognized diabetes mellitus.Clin Infect Dis.1999；29(6):1570-l.);2012年歐洲出現肺炎克雷伯菌肝脈腫病例(Moore R，0'aiea D，Geo曲egan T，Mallon PW, Sheehan G. Community-acquired Klebsiella pneumoniae liver abscess :an emerging infection in Ireland and Europe. Infection 2013;41(3) :681-6.);至今，肺 炎克雷伯菌肝脈腫遍及全球。隨著科技的發展，超聲或CT定位下經皮穿刺引流聯合高效廣 譜抗生素是治療肺炎克雷伯菌肝脈腫的有效方式，但肺炎克雷伯菌肝脈腫病死率仍達4-16%(Wang J,Liu Υ,Lee S,Yen Μ,Chen Y,Wang J,Wann S,Lin H.Primary liver abscess due to Klebsiella pneumoniae in Taiwan.Cl in Infect Dis.1998;26:1434-8)。其主要原因為肺炎克雷伯菌肝脈腫不能及時診斷，從而耽誤有效治療。
[0004] 臨床上，肺炎克雷伯菌肝脈腫常伴發其他部位的感染，常見的是血流感染、眼炎和 腦膜炎。除了其伴發感染的典型癥狀外，肺炎克雷伯菌肝脈腫本身的臨床表現沒有其特征 性，主要表現為發熱、寒戰和腹痛（Chan K，Yu W，Tsai C，Cheng K，Hou C，Lee M，Tan C.Pyogenic liver abscess caused by Klebsiella pneumoniae: analysis of the clinical characteristics and outcomes of 84patients.Chin Med J(Engl)2007；120: 136-39)。其實驗室檢查指標的變化(如白細胞計數、中性粒細胞比例和肝功能指標等)也并 非肺炎克雷伯菌肝脈腫所特異化ee S,畑en Y，Tsai H，Wann S，Lin H，Huang C，Liu Y.Predictors of septic metastatic infection and mortality among patients with Klebsiella pneumonialiver abscess.Clin Infect Dis 2008;47:642-50)。因此，臨床上 往往容易遺漏肺炎克雷伯菌肝脈腫的相關檢查。肺炎克雷伯菌肝脈腫的診斷存在不少的困 難。臨床上，肺炎克雷伯菌肝脈腫的診斷金標準是超聲或CT引導下經皮肝穿刺抽吸脈液，脈 液中分離培養到肺炎克雷伯菌。但是，脈腔中的細菌往往因為患者前期抗生素的使用W及 大量白細胞的吞隧和裂解，多為死菌，培養陽性率較低。血液中分離培養到肺炎克雷伯菌， 結合肝臟脈腔占位的影像學結果，也能作出肺炎克雷伯菌肝脈腫的推測性診斷，但如果是 早期的肝脈腫，脈腔隱匿，影像學上表現不明顯，如不加 W注意，就容易漏診。加之，血培養 耗時長，從血培養陽性報警，到最后鑒定出菌種，還需要24-48小時，耽誤肺炎克雷伯菌肝脈 腫的診斷。
[0005] 本發明目的在于找到致肝脈腫肺炎克雷伯菌的特異性因子，從而通過簡單、快速 的PCR方法篩查運些因子在血培養陽性患者血液中的存在情況，如特異性因子PCR結果陽 性，說明該患者血中很可能存在致肝脈腫肺炎克雷伯菌，提示臨床醫生該患者患肺炎克雷 伯菌肝脈腫概率很高，從而指導臨床醫生及時開具肺炎克雷伯菌肝脈腫相關的檢查，提高 肺炎克雷伯菌肝脈腫的診斷速度，及時治療，為改善患者預后提供基礎。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供了致肝脈腫肺炎克雷伯菌基因特異性序列asnC，所述的基 因特異性序列為SEQ ID NO.2所示。
[0007] 本發明的另一個目的在于提供了致肝脈腫肺炎克雷伯菌基因特異性序列asnC的 引物：
[000引 asnC_F:ATGCTGGATAAGAAAGATAAGGAG
[0009] asnC_R:GCATACTATTGACCTGCGAAACGAA
[0010] 本發明還有一個目的在于提供了致肝脈腫肺炎克雷伯菌基因特異性序列asnC或 基于asnC設計的引物在制備致肝脈腫肺炎克雷伯菌檢測試劑盒中的應用，包括用于制備肺 炎克雷伯菌肝脈腫早期診斷試劑盒中的應用。
[0011] 為了實現上述目的，本發明采用W下技術措施：
[0012] 致肝脈腫肺炎克雷伯菌基因特異性序列asnC，所述的基因特異性序列為SEQ ID NO. 2所示。
[0013] 致肝脈腫肺炎克雷伯菌基因特異性序列asnC的引物，基于asnC序列設計的引物均 為本發明的保護范圍，優選的，asnC的引物為：asnC_F: ATGCTGGATAAGAAAGATAAGGAG; asnC_ R：GCATACTATTGACCTGCGAAACGAA 〇
[0014] 致肝脈腫肺炎克雷伯菌基因特異性序列asnC或基于asnC設計的引物在制備致肝 脈腫肺炎克雷伯菌檢測試劑盒中的應用，包括WasnC序列為有效標記物在制備致肝脈腫肺 炎克雷伯菌檢測試劑盒中的應用，或者W基于asnC序列設計的引物為有效組分在制備致肝 脈腫肺炎克雷伯菌檢測試劑盒中的應用，或者序列asnC或基于asnC設計的引物在制備肺炎 克雷伯菌肝脈腫診斷試劑盒中的應用，該試劑盒還可用于肺炎克雷伯菌肝脈腫早期診斷。
[0015] -種致肝脈腫肺炎克雷伯菌檢測試劑盒，包括：
[0016] sdm_F：TTGAATCTTACCCAGAGGAACTT
[0017] sdm_R：AACAGCACCTTTCACAACGACAT
[0018] asnC_F：ATGCTGGATAAGAAAGATAAGGAG
[0019] asnC_R：GCATACTATTGACCTGCGAAACGAA 〇
[0020] 與現有技術相比，本發明具有W下特點：
[0021 ]目前對致肝脈腫肺炎克雷伯菌分子特征的研究主要局限于篩查普遍報道過的微 生物毒力基因，且特異性不好。本發明通過2株分離自中國大陸的致肝脈腫肺炎克雷伯菌， 對其基因組進行測序，綜合了第二代測序技術(Next-Generation Sequencing，NGS)，比較 基因組學(Comparative Genomics)及生物信息學(Bioinformatics)方法，并采用科學的統 計學方法，更全面、更系統地尋找分析致肝脈腫肺炎克雷伯菌的特異性基因。
[0022] 目前尚無很好的用于肺炎克雷伯菌肝脈腫診斷的分子標志物，而本發明獲得了致 肝脈腫肺炎克雷伯菌Ξ段特異性序列，該序列具有很高的特異性，可W用于肺炎克雷伯菌 肝脈腫的診斷，具有商業化開發價值。
[0023] 申請人從細菌全基因組組學角度出發，從臨床分離到致肝脈腫肺炎克雷伯菌和非 肝脈腫患者血液中分離的肺炎克雷伯菌，送全基因組測序，測序結果與網上公布的致肝脈 腫肺炎克雷伯菌和非致肝脈腫肺炎克雷伯菌全基因組比對分析，結果發現幾個與致肝脈高 度相關的肺炎克雷伯菌基因，分別為sdm、lak和asnC。申請人進一步用sdm、lak、asnC的特異 性引物分別在臨床分離的致肝脈腫和非致肝脈腫肺炎克雷伯菌中做了測試，結果顯示:在 致肝脈腫肺炎克雷伯菌中，sdm的陽性率達100 %，lak和