br>[0040] -、構建重組質粒
[0041 ] 1、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。
[0042] 2、W步驟1得到的雙鏈DNA分子為模板，采用EcoRTYEPF和SalTYEPR組成的引物對 進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0043] EcoRTYEPF:5 '-CGGAATTCATGGTCATCGTTCCTCCAGGATC-3'；
[0044] SalTYEPR:5'-GCGTCGACCTAGGAGTGCAGCATATCCCAC-3'〇
[004引 3、用限制性內切酶EcoRI和Sal I雙酶切步驟2得到的PCR擴增產物，回收酶切產物。
[0046] 4、用限制性內切酶EcoRI和Sail雙酶切PGEX-4T-1載體，回收約4.9kb的載體骨架。
[0047] 5、將步驟3的酶切產物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質粒pGEXTY。根據測序 結果，對重組質粒pGEXTY進行結構描述如下：在PGEX-4T-1載體的EcoR巧日Sail酶切位點之 間插入了序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。
[0048] 6、用限制性內切酶EcoRI和Sail雙酶切pET-30a( + )載體，回收約5.4kb的載體骨 架。
[0049] 7、將步驟3的酶切產物和步驟6的載體骨架連接，得到重組質粒祀TTY。根據測序結 果，對重組質粒PETTY進行結構描述如下：在pET-30a( + )載體的EcoR巧日Sail酶切位點之間 插入了序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。
[0050] 二、制備重組菌
[0051 ] 將重組質粒pGEXTY導入大腸桿菌化21(DE3)，得到重組菌pGEXY。
[0052] 將重組質粒祀TTY導入大腸桿菌化21 (DE3)，得到重組菌祀TY。
[0053] 將PGEX-4T-1載體導入大腸桿菌化21(DE3)，得到重組菌pGEX。
[0054] 將祀T-30a( + )載體導入大腸桿菌化21(DE3)，得到重組菌祀T。
[0055] Ξ、重組菌對草甘麟的抗性
[0056] 分別將重組菌祀TY、重組菌祀T和大腸桿菌化2UDE3)作為待測菌進行如下平行試 驗:將待測菌單克隆接種于含不同濃度草甘麟的LB液體培養基，草甘麟濃度分別為25mmol/ L、50mmol/L、75mmol/L或lOOmmol/L，設置不加入草甘麟的對照處理（即草甘麟濃度為 Ommol/L)，37°C、200巧m振蕩培養7d，然后檢測ODsoor?吸光值。
[0057] 進行五次重復試驗，結果取平均值。
[0058] 結果見圖1。當草甘麟濃度為0-50mmol/L時，大腸桿菌化2UDE3)、重組菌祀TY和重 組菌祀T都能生長。當草甘麟濃度為75mmol/L時，只有重組菌祀TY能夠正常生長。當草甘麟 濃度為lOOmmol/L時，各個待測菌均不能生長。結果表明，轉入EPSI^基因的大腸桿菌提高了 對草甘麟的抗性。
[0059] 四、在大腸桿菌中誘導表達EPSI^蛋白
[0060] 分別將重組菌pGEXY、重組菌pGEX、重組菌祀TY和重組菌祀T作為待測菌進行如下 平行試驗：
[0061] 1、將待測菌接種至1^8液體培養基，37°(3、20化9111振蕩培養至0〇6日(^=0.6。
[0062] 2、完成步驟1后，加入IPTG并使其濃度為0.4111111〇1/1，30°0、170巧111振蕩培養，每隔2 小時取樣，進行SDS-PAGE。
[0063] SDS-PAGE圖譜見圖2。圖2中:A1為重組菌pGEX，A2為重組菌祀T，B1為重組菌pGEXY， B2為重組菌pETY;l-6:依次為IPTG誘導0、2、4、6、8和10小時時取樣的樣品；Μ:蛋白質 Marker〇
[0064] 結果表明，IPTG誘導化后，重組菌pGEXY和重組菌祀TY中的目的蛋白開始表達，隨 著誘導時間的增長，蛋白表達量有所增加，當誘導達到化時，蛋白表達量基本處于穩定狀 態，蛋白誘導表達成功。
【主權項】
1. 一種蛋白，是如下(a)或(b): (a) 由序列表中序列1所不的氣基酸序列組成的蛋白質； (b) 將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且與草甘膦抗性相關的由序列1衍生的蛋白質。2. 編碼權利要求1所述蛋白的基因。3. 如權利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因是如下（1)或(2)或(3)的DNA分子： (1) 編碼區如序列表中序列2所示的DNA分子； (2) 在嚴格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼草甘膦抗性相關蛋白的DNA分子； (3) 與（1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、 至少具有90%、至少具有95%、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98%或至少具有 99%同源性且編碼與草甘膦抗性相關的蛋白的DNA分子。4. 含有權利要求2或3所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。5. 如權利要求4所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為將權利要求2或3所述基 因插入PGEX-4T-1載體或pET-30a (+)載體得到的重組質粒。6. 如權利要求4所述的重組菌，其特征在于:所述重組菌為將權利要求5所述重組載體 導入宿主菌得到的重組菌。7. -種培育重組微生物的方法，包括如下步驟:將權利要求2或3所述基因導入出發微 生物，得到對草甘膦的抗性高于所述出發微生物的重組微生物。8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于:所述微生物為大腸桿菌。9. 權利要求1所述蛋白或權利要求2所述編碼基因或權利要求3所述編碼基因的應用， 為如下(cl)、（c2)或(c3): (c 1)調控植物或微生物對草甘膦的抗性； (c2)增加植物或微生物對草甘膦的抗性； (c3)培育對草甘膦抗性增加的植物或微生物。10. 如權利要求9所述的應用，其特征在于:所述微生物為大腸桿菌。
【專利摘要】本發明公開了一種源自假絲酵母的抗草甘膦相關蛋白及其編碼基因與應用。本發明提供的蛋白，命名為EPSPS蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與草甘膦抗性相關的由序列1衍生的蛋白質。編碼所述EPSPS蛋白的基因(EPSPS基因)也屬于本發明的保護范圍。本發明的基因可用于培育對草甘膦抗性增強的轉基因作物品種或轉基因微生物，具有很高的應用價值。
【IPC分類】C12R1/19, C12N15/70, C12N9/10, A01H5/00, C12N15/54, C12N1/21
【公開號】CN105505895
【申請號】CN201610060445
【發明人】陶波, 邱麗娟, 邵百惠, 于海濤, 曹寶祥, 池源
【申請人】東北農業大學, 中國農業科學院作物科學研究所
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2016年1月28日