一種源自假絲酵母的抗草甘膦相關蛋白及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種源自假絲酵母的抗草甘麟相關蛋白及其編碼基因與應用。
【背景技術】
[0002] 草甘麟理化性質穩定，具有低毒、低殘留、高效、廣譜、滅生性等優點，是全世界除 草劑使用量最大的品種之一。但是草甘麟在殺滅雜草的同時對農作物同樣有著毒害作用， 從而限制了其使用時間和使用范圍。如果有對草甘麟具有抗性或降解作用的農作物出現， 則有利于草甘麟在農業生產中的應用并降低生產成本。因此，抗除草劑基因的發掘與利用 已成為當今生物基因工程領域研究的重點。
[0003] 草甘麟作為一種芳香族氨基酸合成過程中的抑制劑，其主要作用祀標是5-締醇丙 酬莽草酸-3-憐酸脂合成酶化PSPS) dEPSPS存在于所有植物葉綠體、真菌和細菌中，它催化 莽草酸-3-憐酸和憐酸締醇丙酬酸合成EPSP，從而進一步合成芳香族氨基酸。因為EPSPS被 草甘麟抑制，使經EPSI^催化由憐酸締醇式丙酬酸與莽草酸-3-憐酸向5-締醇丙酬莽草酸-3-憐酸的轉變過程停止，植物中的莽草酸含量增加，芳香族氨基酸合成減弱或停止，隨之植 物失綠而死亡。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種源自假絲酵母的抗草甘麟相關蛋白及其編碼基因與應 用。
[000引本發明提供的蛋白，獲自假絲酵母，命名為EPSPS蛋白，是如下(a)或(b):
[0006] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0007] (b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且與草甘麟抗性相關的由序列1衍生的蛋白質。
[0008] 為了使(a)中的蛋白質便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的 蛋白質的氨基末端或簇基末端連接上如表1所示的標簽。
[0009] 表1標簽的序列
[0010]
[0011]上述(b)中的蛋白質可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。 上述(b)中的蛋白質的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個 氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5/端和/或y端 連上表1所示的標簽的編碼序列得到。
[0012] 編碼所述EPSI^蛋白的基因化PSPS基因）也屬于本發明的保護范圍。
[0013] 所述EPSI^基因是如下（1)或(2)或(3)的DNA分子：
[0014] (1)編碼區如序列表中序列2所示的DNA分子；
[001引（2化嚴格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼草甘麟抗性相關蛋白的DNA分 子；
[0016] (3)與（1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98%或至少具 有99%同源性且編碼與草甘麟抗性相關的蛋白的DNA分子。
[0017]所述嚴格條件可為如下:在6 X SSC，0.5 % SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2 X SSC，0.1 % SDS和 1 X SSC，0.1 % SDS各洗膜一次。
[0018] 含有所述EPSI^基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發明的 保護化圍。
[0019] 所述重組載體具體可為將所述EPSPS基因插入PGEX-4T-1載體或pET-30a (+)載體 得到的重組質粒。所述重組載體具體可為在PGEX-4T-1載體的EcoR巧日Sail酶切位點之間插 入序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子得到的重組質粒。所述重組載體具體可為在祀T-30a (+ )載體的EcoRI和Sail酶切位點之間插入序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子得到的重組 質粒。
[0020] 所述重組菌為將W上任一所述重組載體導入宿主菌得到的重組菌。所述宿主菌可 為大腸桿菌，具體可為大腸桿菌化21 (DE3)。
[0021] 本發明還保護一種培育重組微生物的方法，包括如下步驟:將所述EPSI^基因導入 出發微生物，得到對草甘麟抗性高于所述出發微生物的重組微生物。所述EPSPS基因具體可 通過W上任一所述重組載體導入所述出發微生物。所述出發微生物可為細菌，具體可為大 腸桿菌，更具體可為大腸桿菌化21 (DE3)。
[0022] 本發明還保護所述EPSPS蛋白或所述EPSPS基因的應用，為如下（cl)、（c2)或（c3) 中的至少一種：
[0023] (cl)調控植物或微生物對草甘麟的抗性；
[0024] (c2)增加植物或微生物對草甘麟的抗性；
[0025] (c3)培育對草甘麟抗性增加的植物或微生物。
[0026] 所述微生物可為細菌，具體可為大腸桿菌，更具體可為大腸桿菌化2UDE3)。
[0027] 本發明發現了一個新的蛋白，將其編碼基因轉入大腸桿菌中表達，可提高轉基因 菌株對草甘麟的抗性。因此，本發明的基因可用于培育對草甘麟抗性增強的轉基因作物品 種或轉基因微生物，具有很高的應用價值。
【附圖說明】
[0028] 圖1為實施例2的步驟Ξ的結果。
[0029] 圖2為實施例2的步驟四的結果。
【具體實施方式】
[0030] W下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。W下實施例中的定量試驗，均設置Ξ次重復實驗，結果取平 均值。PGEX-4T-1載體：GE Healthcare公司。祀T-30a( + )載體：購自Novagen公司。大腸桿菌 化2UDE3):購自天根生化科技有限公司，產品目錄號為CB105-02。草甘麟：美國孟山都公 司。
[0031] 草甘麟的結構式如下：
[0032]
[0033] 實施例UEPSPS蛋白及其編碼基因的發現
[0034] 2010年6月，從草甘麟生產公司排污口（浙江新安化工集團股份有限公司）采集± 樣。從±樣中純合得到一株具有草甘麟抗性的菌株，將其命名為TY-JM。
[003引提取TY-JM的基因組DNA并作為模板，采用NS-1和NS-8組成的引物對擴增8S rRNA 的編碼序列，然后回收PCR擴增產物并測序，其與假絲酵母菌(Candida palmioleo地ila)的 序列同源性高達99 %。
[0036] 結合分子鑒定、形態學觀察和生理生化特性測定，將菌株TY-JM確定為假絲酵母菌 (C曰ndid曰 P曰Imioleophil曰）。
[0037] 從假絲酵母TY-JM中發現了一個新的與草甘麟抗性相關的蛋白，如序列表的序列1 所示。
[0038] 將序列表的序列1所示的蛋白質命名為EPSPS蛋白。將編碼EPSPS蛋白的基因命名 為EPSI^基因，其開放閱讀框如序列表的序列2所示。
[0039] 實施例2、EPSI^蛋白的功能驗證<