04引圖1為表達抗體重鏈的重組質粒圖譜；
[0046] 圖2為表達抗體輕鏈的重組質粒圖譜；
[0047] 圖3為肥R2抗體純化后的SDS-PAGE結果；
[004引圖4為CD3抗體純化后的SDS-PAGE結果。
【具體實施方式】
[0049] -種進行抗體表達和組裝的重組系統，所述重組系統包括宿主細胞和重組載體。
[0050] -種進行抗體表達和組裝的重組系統，所述重組系統包括宿主細胞和重組載體。 [0051 ]所述宿主細胞為C冊細胞或293F細胞。
[0052] 所述重組載體包括重鏈區域表達載體pR化1-肥和輕鏈區域表達載體pR化1-LC，重 組載體的載體骨架為pCTL載體。
[0053] 所述重組載體的測序引物，正向測序引物序列如SEQ ID NO: 15所示，反向測序引 物如沈Q ID NO: 16所示。
[0054] 所述重組載體可分別編碼抗體的重鏈和輕鏈，重鏈氨基酸序列如SEQ ID NO:3所 示，輕鏈氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示。
[00巧]所述抗體片段選自IgG、Fab、Fv或ScFv-Fc。
[0056] 所述pRTL載體骨架包含CMV enhancor/hFerL promter復合啟動子和IL2信號膚， 啟動子和信號膚不限于一種，可選自11。6仕山日。1寸化￥、116、化、64?或〔31￥，信號膚可選自外 源蛋白自身的天然信號膚、IL2、Igkappa或hGHWL
[0057] 所述pR化1-HC表達載體的核巧酸序列如SEQ ID N0:1所示的，pRTLl-LC表達載體 的核巧酸序列如SEQ ID NO:2所示的。
[0058] 所述重組載體的構建方法如下：
[0059] (l)pRTLl-HC 改造設計
[0060] a.將含有 Fd 區域的 pFabZipl 克隆載體 GenBank:AY190524 中 2364bp 到 2666bp 的序 列，與P即沈-hFc2-adapt-ScFv載體GenBank: FJ716123上的姑1、姑2、姑3恒定區序列融合得 到融合片段Fd-姑1-姑2-姑3;在融合片段的Fd端上加 EoRI酶切位點，Ch3端上加 Nhel酶切位 點，人工合成該部分元件序列如SEQ ID NO: 13所示；
[0061] b.如SEQ ID顯：13所示的元件序列和改造載體9。1156-}1。〇2-曰(1曰91-5〇。￥分別經 EcoRI和Nhel雙酶切后連接，完成表達完整的具有較鏈區的IgG重鏈質粒的構建，命名為 pRTL載體；
[0062] C. W抗肥R2抗體的Vh序列為模板，從EcoRI處設計正向引物a如SEQ ID N0:5所示， 再設計反向引物b如SEQ ID NO:6所示，擴增Vh序列;正向引物C如SEQ ID NO:7所示，Ch3尾加 Xbal切點設計的反向引物d如SEQ ID N0:8所示，一同擴增Fd-CHl-CH2-CH3融合序列;通過重 疊延伸 PCR 將 Vh 和 Fd-CHl-CH2-CH3 進行融合得 VH-Fd-CHl-CH2-CH3;
[0063] d.用T4 DNA連接酶連接經EcoRI和Xbal雙酶切的VH-Fd-姑1-Ch2-姑3融合產物和經 EcoR巧日Nhel雙酶切的pR化載體，其中Xbal和Nhel為同尾酶，經連接后，運兩個酶切位點消 失，得到pRTLl-肥載體；
[0064] (2)pRTLl-LC 改造設計
[0065] a.將pMThIgGl-V表達載體GenBank:AM408495中56化p到88化p的Cl區域序列如沈Q ID NO: 14所示，通過人工合成得到具有EcoRI、BsiWI和化el酶切位點的Cl區域片段；
[0066] b.將人工合成的Cl區域序列經EcoR巧日Nhel雙酶切后連接到經同樣EcoR巧日Nhel 雙酶切的pFUSE-hFc2-adapt-ScFv骨架載體上，完成表達抗體輕鏈的質粒的構建，命名為 pRTL'載體；
[0067] C. W抗皿R2抗體的化序列為模板，WEcoRI處設計正向引物e序列如SEQ ID N0:9 所示和從Cl的端序列設計帶有BsiWI酶切位點的反向引物f如SEQ ID N0:10所示為引物， PCR擴增化序列；
[0068] d.用T4 DNA連接酶連接經EcoR巧郵siWI雙酶切的步驟C中純化的PCR產物和pR化' 載體，得到pCTLl-LC載體；
[0069] (3)WpR化1-肥和pR化1-LC重組載體在共轉染宿主細胞，表達完整的IgG抗體。
[0070] 所述重鏈區域表達載體用EcoRI和化el雙酶切并與所需的Vh連接，轉化獲得質粒， 轉染真核細胞即可表達抗體的IgG重鏈;所述輕鏈區域表達載體用EcoRI和BsiWI雙酶切并 與所需的化連接，轉化獲得質粒，轉染真核細胞表達抗體的輕鏈;所述重組系統在共轉染宿 主細胞后表達抗體。
[00川下面結合具體實施例，進一步闡述本發明，所用酶如無特別說明均為NEB公司產 品，人工合成的序列如無特殊說明均由北京京維智生物科技有限公司合成。
[0072] 實施例1
[0073] 一、肥R2抗體序列真核表達載體的構建
[0074] W肥R2-HC質粒為模板，W引物a和引物b進行PCR擴增。其中，引物a序列如SEQ ID NO: 5所示，其中GAATTC為EcoRI識別位點；引物b序列如SEQ ID NO: 6所示，其中GCTAGC為 Nhel識別位點。在一滅菌的0.2ml PCR管中，依次加入12μ1無菌水、7μ1的2 XTaq master miX酶(康為世紀公司），0.2μ 1的引物a (終濃度化mo 1)、0.2μ 1的引物b (終濃度化mo 1)、1 Ong 的質粒溶液(濃度為58化g/μL)，用無菌水補足至總體積20μ1，將離屯、管至于PCR儀中。在PCR 反應體系中，PCR反應的溫度變化過程為:先升溫至94°C，保持5分鐘，接著按W下的溫度變 化程序循環30次:升溫至94°C，保持20秒，降溫至60°C，保持20分鐘，升溫至72°C，保持40秒， 最后于72°C保持10分鐘，結束擴增反應。經PCR擴增，得到兩端分別帶有EcoRI和化el的限制 性內切酶酶切的插入片段，然后用PCR純化試劑盒(QIAGEN，化t. No. 28004)按照說明書進行 PCR產物的純化。利用DNA含量測定儀化no化op 2000c測定DNA的濃度。將純化的PCR產物和 pRTLl-肥載體分別進行酶切反應。PCR產物的酶切體系為:PCR產物：lyg; 10 X buff er4:化1; EcoRI-HF: 1μ1 ;NheI-HF: 1μ1 ;BSA:0.2μ1;補足d地2〇至20μ1 ;pRTLl-肥載體的酶切體系為： pRTLl-HC載體：lyg; 10 X buf f er4:化1; EcoRI-HF:化1; MieI-HF: 1μ1; BSA: 0.2μ1;補足dd出0 至20μ1。37°C酶切化。1 %的瓊脂糖凝膠電泳，利用膠回收試劑盒(QIAGEN，化t. No. 28706)按 照說明書進行切膠回收酶切后的產物。利用DM含量測定儀化no化op 2000c測定DNA的濃 度。回收DNA產物用T4 DNA連接酶連接到用EcoR巧日Nhel限制性內切酶酶切的pR化1-肥載體 骨架上。連接體系中插入片段DNA與載體的摩爾比最好為7:1。連接體系為:插入片段DNA: 12：3ng;酶切后的pRTLl-肥載體 100ng;10XT4 DNA ligase buffer:2yl;T4 DNA連接酶：1μ 1;補足dd出0至20μ1，16°C連接化。
[007引 W皿R2-LC質粒為模板，W引物e和引物f進行PCR擴增化基因。其中，引物e序列如 SEQ IDN0:7所示，其中GAATTC為EcoRI識別位點；引物f序列如SEQ ID N0:8所示，其中 CGTACG為BsiWI識別位點。在一滅菌的0.2ml PCR管中，依次加入12μ1無菌水、7μ1的2X化q master mix酶（康為世紀公司），0.化1的引物e(終濃度2ρπιο1)、0.2μ1的引物f(終濃度 2pmol)、10ng的質粒溶液(濃度為667ng/yl)，用無菌水補足至總體積20μ1，將離屯、管至于 PCR儀中。在PCR反應體系中，PCR反應的溫度變化過程為:先升溫至94°C，保持5分鐘，接著按 W下的溫度變化程序循環30次:升溫至94°C，保持20秒，降溫至60°C，保持20分鐘，升溫至72 °C，保持40秒，最后于72°C保持10分鐘，結束擴增反應。經PCR擴增，得到兩端分別帶有EcoRI 和BsiWI的限制性內切酶酶切的插入片段，然后用PCR純化試劑盒(QIAGEN，Cat.No.28004) 按照說明書進行PCR產物的純化。利用DNA含量測定儀NanoDrop 2000c測定DNA的濃度。將純 化的PCR產物和pITTLl-LC載體分別進行酶切反應。PCR產物的酶切體系為:PCR產物：lyg;10 X buf f er4:化1; EcoRI-HF: 1μ1; BsiWI: 1μ1; BSA: 0.2μ1;補足dd出0至20μ1; pRTLl-肥載體的 酶切體系為：pRTLl-肥載體：lyg; 10 X buff er4:化1;EcoRI-HF: 1μ1; BsiWI: 1μ1; BSA: 0.2μ1; 補足d d化0至2 0 μ 1。3 7 °C酶切化。1 %的瓊脂糖凝膠電泳，利用膠回收試劑盒（QIA G Ε Ν， Cat. No . 28706)按照說明書進行切膠回收酶切后的產物。利用DNA含量測定儀化no化op 2000c測定DNA的濃度。回收DNA產物用T4 DNA連接酶連接到用EcoR巧郵siWI限制性內切酶 酶切的pCTLl-LC載體骨架上。連接體系中插入片段DNA與載體的摩爾比最好為7:1。連接體 系為：插入片段DNA:12：3ng;酶切后的pRTLl-LC載體 100ng;10XT4 DNA ligase buffer:2y 1; Τ4 DNA連接酶：1μ1;補足d地20至20μ1。16°C連接化。
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