進行抗體表達和組裝的重組系統及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學和蛋白質技術領域，具體設及抗體表達和組裝的重組系統 及應用。 技術背景
[0002] 自抗體研究W來，許多棘手的臨床疾病對于醫生來說并非不可能。隨著技術的不 斷發展，抗體的研究也有了突飛猛進的進步。抗體的研究也進入新階段，從最初簡單的抗體 到鼠源化抗體，再到如今的人源化抗體。如今人源化抗體的不斷進步和完善，在醫學領域得 到了廣泛應用，在醫學領域的應用已顯示出它巨大的潛力。
[0003] 人源化抗體是在嵌合抗體的基礎上減少鼠源成分，保留鼠抗體CDR區，其余全部替 換成人抗體相應部分，經過改型抗體，人源成分達90%即為所指的人源化抗體。在疾病治療 中，人源化抗體優于鼠源化抗體，不僅因為抗體中鼠源性成分的減少降低了機體的免疫排 斥反應，還在于人源化抗體中化段，能夠誘發機體的效應機能募集效應因子或效應細胞，后 者對祀細胞具有殺傷作用。還有一個優點在于人源化抗體在體內的半衰期可達數天，而鼠 源抗體的半衰期則不到20h。
[0004] 隨著抗體工程的發展，建立在隧菌體外殼表達抗體片段的能力基礎上的隧菌體展 示技術產生，即從免疫后的脾細胞、外周血淋己細胞等提取mRNA，逆轉錄成cDNA，利用PCR技 術分別擴增出抗體的重鏈及輕鏈基因，按一定的方式將兩者連接克隆到表達載體上，并在 適當的宿主細胞中表達成有功能的抗體分子，從而利用抗原-抗體特異性結合進行篩選、擴 增，再用親和層析等手段純化抗體片段。
[000引近幾年來，隨著對鼠單克隆抗體的人源化技術越來越成熟，大量的人源化抗體被 用于臨床治療腫瘤疾病研究，它已成為繼手術切除、放療及化療后又一治療腫瘤的藥物。因 此研究有利于表達人源化抗體的載體骨架也變的至關重要。
[0006] WpR化骨架為基礎的表達人源化抗體的真核載體已有一些研究，PRTL質粒的特 占 . y ?、、·
[0007] hEFl-HTLV啟動子是一個含有延伸因子-Ια化F-la)核屯、啟動子和人類T細胞白血 病病毒化化V)I型長末端重復區域的R片段和R-U5,序列的復合啟動子。在體外轉基因研究 中EF-化啟動子展示出很強的活性，并啟動產生持久的表達。R-肌，和EF-la-同W提高RNA 的穩定性。
[0008] SV4化An:猿猴病毒40晚期多聚腺巧酸化信號促使有效的分割和聚腺巧酸化反應， 導致大量穩定態mRNA的產生。
[0009] 化i :一個最短的E.coli復制起點，它可用來控制載體的大小，但是與長的化i具有 相同的活性。
[0010] CMV enhancor/hFerLpromter:運種復合啟動子由人類巨細胞病毒immediate-early基因1增強子和人類鐵蛋白輕鏈基因的核屯、啟動子所組成。運個普遍存在的啟動子引 導Zeocin?抗性基因在哺乳動物細胞中的表達。
[0011] EM2KC:是一個細菌啟動子，它能夠使抗性基因在E.coli細胞內中持續表達。EM2KC 位于內含子內，是在哺乳動物細胞中被剪切掉。
[0012] WlopAn:人beta-globin 3，UTR和多腺巧酸化序列能夠讓轉基因轉錄得到有效捕 獲。
[0013] Human IgHGUlgGl重鏈恒定區）：當將重鏈可變區插入到多克隆位點時，務必注意 讀碼框的正確，W保證重鏈恒定區的完整。
[0014] Zeocin:抗 Zeocin 抗性序列是來源于 Str 邱 1:〇日11〇16；[油11311；[]1山131:日]1113的化1316基 因。運個基因可用于哺乳動物和原核生物如E.coli的抗性選擇。運種抗生素可用來分離對 其它篩選劑(如:慶大霉素，潮霉素)有抗性的克隆。Zeocin是一種屬于爭光霉素家族的糖蛋 白抗生素，在體內能作用于大多數細菌(包括E.coli)、真菌(如:酵母菌）、植物細胞、動物細 胞。
[0015] 所述重組載體為一種穿梭質粒，具有兩種不同復制起點，因而可W在真核和原核 兩種不同類群宿主中存活和復制的質粒載體。為了提高表達效率，本載體在起始密碼子側 翼加上了Kozak序列，后期在設計插入基因時不必考慮Kozak序列的引入問題。所述重組載 體是真核原核細胞共用一個抗性篩選標記，為:zeocin抗性，在原核質粒制備系統中的使用 濃度為25μg/ml，在真核表達系統中的篩選濃度約為5(K)μg/ml，不同真核細胞抗性篩選濃度 稍有不同。
[0016] 將插入序列連接到由限制性內切酶酶切的載體后，在原核細胞中純化質粒，共轉 染至相對應的真核宿主細胞(293F細胞或C冊細胞），表達具有功能的各類抗體。
【發明內容】
[0017] 本發明提供一種進行抗體表達和組裝的重組系統，所述重組系統包括宿主細胞和 重組載體。
[0018] 本發明的技術方案是：
[0019] -種進行抗體表達和組裝的重組系統，所述重組系統包括宿主細胞和重組載體。
[0020] 所述宿主細胞為C冊細胞或293F細胞。
[0021 ] 所述重組載體包括重鏈區域表達載體pR化1-肥和輕鏈區域表達載體pR化1-LC，重 組載體的載體骨架為pCTL載體。
[0022] 所述重組載體的測序引物，正向測序引物序列如SEQ ID NO: 15所示，反向測序引 物如沈Q ID NO: 16所示。
[0023] 所述重組載體可分別編碼抗體的重鏈和輕鏈，重鏈氨基酸序列如SEQ ID NO:3所 示，輕鏈氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示。
[0024] 所述抗體片段選自IgG、Fab、Fv或ScFv-Fc。
[00巧]所述pR化載體骨架包含CMV enhancor/hFerL promter復合啟動子和IL2信號膚， 啟動子和信號膚不限于一種，可選自11。6仕山日。1寸化￥、116、化、64?或〔31￥，信號膚可選自外 源蛋白自身的天然信號膚、IL2、Igkappa或hGHWL
[0026] 所述pR化1-HC表達載體的核巧酸序列如SEQ ID N0:1所示的，pRTLl-LC表達載體 的核巧酸序列如SEQ ID NO:2所示的。
[0027] 所述重組載體的構建方法如下：
[002引 （l)pRTLl-肥改造設計
[0029] a.將含有 Fd 區域的 pFabZipl 克隆載體 GenBank:AY190524 中 2364bp 到 2666bp 的序 列，與P即沈-hFc2-adapt-ScFv載體GenBank: FJ716123上的姑1、姑2、姑3恒定區序列融合得 到融合片段Fd-姑1-姑2-姑3;在融合片段的Fd端上加 EoRI酶切位點，Ch3端上加 Nhel酶切位 點，人工合成該部分元件序列如SEQ ID NO: 13所示；
[0030] b.如SEQ ID顯：13所示的元件序列和改造載體9。1156-}1。〇2-曰(1曰91-5〇。￥分別經 EcoRI和Nhel雙酶切后連接，完成表達完整的具有較鏈區的IgG重鏈質粒的構建，命名為 pRTL載體；
[0031 ] C. W抗肥R2抗體的Vh序列為模板，從EcoRI處設計正向引物a如SEQ ID N0:5所示， 再設計反向引物b如SEQ ID NO:6所示，擴增Vh序列;正向引物C如SEQ ID NO:7所示，Ch3尾加 Xbal切點設計的反向引物d如SEQ ID N0:8所示，一同擴增Fd-CHl-CH2-CH3融合序列;通過重 疊延伸 PCR 將 Vh 和 Fd-CHl-CH2-CH3 進行融合得 VH-Fd-CHl-CH2-CH3;
[0032] d.用T4 DNA連接酶連接經EcoRI和Xbal雙酶切的VH-Fd-姑1-Ch2-姑3融合產物和經 EcoR巧日Nhel雙酶切的pR化載體，其中Xbal和Nhel為同尾酶，經連接后，運兩個酶切位點消 失，得到pRTLl-肥載體；
[0033] (2)pRTLl-LC 改造設計
[0034] a.將pMThIgGl-V表達載體GenBank:AM408495中56化P到88化P的Cl區域序列如沈Q ID NO: 14所示，通過人工合成得到具有EcoRI、BsiWI和化el酶切位點的Cl區域片段；
[003引 b.將人工合成的Cl區域序列經EcoRI和Nhel雙酶切后連接到經同樣EcoRI和Nhel 雙酶切的pFUSE-hFc2-adapt-ScFv骨架載體上，完成表達抗體輕鏈的質粒的構建，命名為 pRTL'載體；
[0036] C. W抗皿R2抗體的化序列為模板，從EcoRI處設計正向引物e序列如SEQ ID N0:9 所示，從Cl的端BsiWI酶切位點序列處設計反向引物f如SEQ ID NO: 10所示和正向引物g如 SEQ ID NO: 11所示，從化el處設計反向引物h如SEQ ID NO: 12所示，PCR擴增化序列；
[0037] d.用T4 DNA連接酶連接經EcoR巧郵siWI雙酶切的步驟C中純化的PCR產物和pR化' 載體，得到pCTLl-LC載體；
[003引（3)WpR化1-肥和pR化1-LC重組載體在共轉染宿主細胞，表達完整的IgG抗體。
[0039] 所述重鏈區域表達載體用EcoRI和化el雙酶切并與所需的Vh連接，轉化獲得質粒， 轉染真核細胞即可表達抗體的IgG重鏈;所述輕鏈區域表達載體用EcoRI和BsiWI雙酶切并 與所需的化連接，轉化獲得質粒，轉染真核細胞表達抗體的輕鏈;所述重組系統在共轉染宿 主細胞后表達抗體。
[0040] 本發明的有益效果：
[0041] 1.本發明利用分子克隆技術可將抗肥R2、CD3等抗體序列克隆至真核表達載體，并 使其在細胞中大量表達，且純化得到其表達產物，為表達人類IgG抗體提供重要的參考。
[0042] 2.本發明專利的主要優勢在于在不改變抗體骨架氨基酸的序列前提下，能夠高效 表達相對應的由Η鏈和L鏈組成的天然狀態的人源抗體。
[0043] 3.本發明中的重組載體是真核原核細胞共用一個抗性篩選標記，為zeocin抗性， 在原核質粒制備系統中的使用濃度為25μg/ml，在真核表達系統中的篩選濃度約為50化邑/ ml。
[0044]說明書附圖
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