進樣;柱溫:30°C;檢測波長:254nm。
[0125] (3)甘露醇含量的測定：
[0126] 取甘露醇對照品500mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加質量百分濃度70%甲醇水溶 液溶解并稀釋至刻度。搖勻，作為對照品儲備液。
[0127] 稱取2.0g的樣品置圓底燒瓶中，加50ml質量百分濃度70%甲醇水溶液回流提取 30min。濾液過濾后置50ml容量瓶中，用質量百分濃度70%甲醇水溶液定容到刻度。搖勻，即 得。
[0128] 色譜條件：氨基柱(UG 5μπι，250mm X 4 · 6mm);乙腈-水（體積比81:19)溶液為流動 相;流速為1. 〇ml/min;漂移管溫度為90°C;載氣(空氣)壓力為2.75Bar;進樣量20μ1。
[0129] 表1各實施例和對比例主要成分檢測結果
[0130]
[0131] 注:與對比例1、對比例2比較，Δ :Ρ〈〇.〇5。
[0132] 表1的數據顯示，本發明中國被毛孢發酵培養組合物，大幅度同時提高了產物中多 糖、腺苷、蟲草素、甘露醇等活性成分的含量。與對比例1常規培養方法相比，采用本發明方 法獲得的中國被毛孢發酵培養組合物中多糖含量提高了47.9 %-52.1 %，腺苷含量提高了 23.1%-38.5%，蟲草素含量提高了33.3%-53.3%，甘露醇含量提高了30.9%-40%。
[0133] 護肝功能試驗
[0134] 實驗動物:雄性昆明種小鼠，體重18±2g。分籠飼養，自由飲食，觀察3天后用于試 驗。
[0135] 實驗設計：按照《保健食品檢驗與評價技術規范》（2003版)評價標準進行，設低、 中、高3個劑量受試組和1個陰性基礎對照組及1個模型對照組，低、中、高3個劑量組分別相 當于人用最大推薦劑量的5倍、10倍、20倍，8卩0.15、0.30、0.6(^/1^*1^/(1，低、中、高3個劑 量配制濃度分別為15、30、6〇 1^/111匕基礎對照組和模型對照組均給予蒸餾水，所有實驗動物 均食用全價營養配合飼料，自由攝食飲水。
[0136] 經口每日一次給予小鼠相應劑量的受試物，小鼠灌胃量為10mL/kg · bw，連續灌胃 30d，于實驗第30天將各組動物隔夜禁食16h。模型對照組及受試組一次灌胃給予1%CC14植 物油溶液(5mL/kg · BW)，基礎對照組給予植物油，受試組繼續給予實施例制得的組合物、對 比例1中中國被毛孢發酵產物或對比例2中提取物至實驗結束（與CC1 4灌胃間隔4h)，給予 CCl424h后小鼠摘取眼球取血，測定血清ALT、AST水平，并取肝臟進行組織病理學檢查。
[0137] 實驗結果：
[0138] 1.各實施例制得的組合物對小鼠體重的影響
[0139]由表2可知，對各組小鼠試驗的初始體重/結束體重（30d)的均值進行單因素方差 分析，差異無顯著性(P>〇.05)，結果表明各實施例制得的組合物和對比例中產品對動物的 體重未見明顯影響。
[0140] 2.對CC14肝損傷小鼠血清ALT及AST的影響
[0141] 由表3可知，模型對照組小鼠的ALT、AST含量高于陰性基礎對照組，經統計分析差 異有統計學意義(P<〇 .05)，實施例制得的組合物0.15、0.30、0.60g/kg · bw/d劑量組的ALT 值低于模型對照組，經統計分析差異有統計學意義(P<〇. 05);低中高劑量組的AST值低于 模型對照組，經統計分析差異有統計學意義(P<〇.05)。結果表明，實施例1-3制得的組合物 在相當于人體推薦攝入量的5倍、10倍和20倍劑量時，具有降低化學性肝損傷小鼠血清ALT 和AST的作用，且相同劑量下實施例1-3制得的組合物各項指標與比對比例1和對比例2相比 具有顯著性差異(P<〇.05)，表明本發明組合物與常規培養方法、提取方法得到的產物相比 護肝效果更加明顯。
[0142] 3.實施例制得的組合物對CC14肝損傷小鼠肝臟組織病理學的影響
[0143] 由表4可知，對各組小鼠肝臟組織病理學指標量化值的均值進行單因素方差分析， 各項指標均與模型對照組比較差異有顯著意義。結果表明，實施例1-3制得的組合物在相當 于人體推薦攝入量的5倍、10倍和20倍劑量時，動物實驗病理結果為陽性，表明其具有減輕 化學性肝損傷小鼠肝臟的病理性損害作用，且相同劑量下實施例1-3制得的組合物各項指 標與比對比例1和對比例2相比具有顯著性差異(P<0.05)，表明本發明組合物與常規培養 方法、提取方法得到的產物相比護肝效果更加明顯。
[0144]表2實施例和對比例制得的膠囊對小鼠體重的影響
[0147]表3實施例和對比例制得的膠囊對小鼠血清ALT及AST的影響
[0149]表4實施例制得的膠囊對CC14肝損傷小鼠肝臟組織病理學的影響
[0152]在本發明配方和制備方法限定的范圍內各參數的變化并不影響本發明中國被毛 孢發酵培養組合物及其軟膠囊產品化學性肝損傷的改善功效和制備，因此本發明配方和制 備方法中任意參數的組合均可得到中國被毛孢發酵培養組合物及其軟膠囊產品。在此不再 贅述。
【主權項】
1. 一種中國被毛孢發酵培養方法，其特征在于，包括步驟： (1) 取活化后的中國被毛孢菌種接種到液體MRS培養基中培養4天-15天，離心收集第一 菌體;將第一菌體懸浮在含膽鹽的液體MRS培養基中于18°C_30°C孵育lh-20h，離心收集第 二菌體;將第二菌體經PBS緩沖液清洗干凈后重新懸浮于液體MRS培養基中，震蕩搖勻得到 第二菌體液，將第二菌體液接種到含膽鹽的液體MRS培養基中于18°C_30°C再培養2天-20 天，得到中國被毛孢種子液； (2) 取活化后的米根霉菌種接種到液體MRS培養基中培養3h-30h，離心收集第三菌體， 將第三菌體懸浮在含NaCl的液體MRS培養基中于20°C_30°C孵育0.5h-15h，離心收集第四菌 體;將第四菌體經PBS緩沖液清洗干凈后重新懸浮于液體MRS培養基中，震蕩搖勻得到第四 菌體液，將第四菌體液接種到含NaCl的液體MRS培養基中于20°C_30°C培養3h-30h，得到米 根霉種子液； (3) 將步驟(2)的米根霉種子液接入米根霉固態發酵培養基中，在20°C_30°C培養3天-30天，然后置于交變磁場環境中再培養5天-20天，培養產物經真空冷凍干燥、粉碎后得米根 霉固態發酵產物;所述米根霉固態發酵培養基中含有金鐵鎖和玉竹； (4) 將步驟(3)的米根霉固態發酵產物經亞臨界水萃取，得到米根霉發酵亞臨界萃取物 I，萃取后所剩的殘渣經真空冷凍干燥后得到萃取剩余物Π ; (5) 將步驟（1)的中國被毛孢種子液接入中國被毛孢液體發酵培養基中，調pH值為3-7， 在15°C_25°C培養5天-25天，離心，得到中國被毛孢發酵產物ΙΠ ;所述中國被毛孢液體發酵 培養基中含有萃取剩余物Π ; 中國被毛孢發酵培養組合物為米根霉發酵亞臨界萃取物I和中國被毛孢發酵產物m。2. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述米根霉固態發酵培養 基每1L中含有5.5g-8.5g金鐵鎖和0.2g-4.0g玉竹。3. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(5)中，所述中國被毛孢液體發酵 培養基每1L中含有0.2g-lg萃取剩余物Π 。4. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)中，所述含膽鹽的液體MRS培 養基中膽鹽的質量百分含量為0.05%-0.5% ; 步驟(2)中，所述含NaCl的液體MRS培養基中NaCl的質量百分含量為0.5 % -8 %。5. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述第一菌體與用于懸浮 第一菌體的含膽鹽的液體MRS培養基的體積比為1:1-3,第二菌體與用于懸浮第二菌體的液 體MRS培養基的體積比為1:1-3,第二菌體液的接種量為5% ; 步驟(2)中，所述第三菌體與用于懸浮第三菌體的含NaCl的液體MRS培養基的體積比為 1:1-3,第四菌體與用于懸浮第四菌體的液體MRS培養基的體積比為1:1-3,第四菌體液的接 種量為3 %。6. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述交變磁場環境中磁場 強度為〇. 2mT-6mT，磁場頻率為3Hz-40Hz; 步驟(4)中，所述亞臨界水萃取的條件為：水料質量比為10-50:1，萃取壓力在4MPa-25MPa，萃取溫度為100°C-180°C，萃取時間為10min-90min。7. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，米根霉種子液的接入量為 米根霉固態發酵培養基體積的5%-25% ; 步驟（5)中，所述中國被毛孢種子液的接入量為中國被毛孢液體發酵培養基體積的 3%-20%〇8. -種中國被毛孢發酵培養組合物，其特征在于，采用權利要求1-7任一項所述的制備 方法制備得到。9. 根據權利要求8所述的中國被毛孢發酵培養組合物，其特征在于，所述組合物由40重 量份-55重量份米根霉發酵亞臨界萃取物I和20重量份-35重量份中國被毛孢發酵產物ΙΠ 組 成。10. -種中國被毛孢發酵培養組合物的應用，其特征在于，根據權利要求8或9所述的中 國被毛孢發酵培養組合物在制備護肝的保健品或藥品中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種中國被毛孢發酵培養方法，包括：將米根霉種子液接入含有金鐵鎖和玉竹的米根霉固態發酵培養基中培養，然后置于交變磁場環境中再培養，得米根霉固態發酵產物，再經亞臨界水萃取，得到米根霉發酵亞臨界萃取物Ⅰ；將中國被毛孢種子液接入含有萃取剩余物Ⅱ的中國被毛孢液體發酵培養基中培養，得到中國被毛孢發酵產物Ⅲ；組合物為米根霉發酵亞臨界萃取物Ⅰ和中國被毛孢發酵產物Ⅲ，具有良好的護肝功能。該方法能夠有效地將各原料中的營養成分和有效成分進行生物降解和轉化，有助于提高最終產品中活性成分的含量和活性。
【IPC分類】C12P19/04, C12R1/645, C12P7/18, A61K36/062, A61P1/16, C12P19/32, C12P19/40, C12N1/14
【公開號】CN105505792
【申請號】CN201511025968
【發明人】程俊文, 賀亮, 胡傳久, 魏海龍, 李海波, 付立忠
【申請人】浙江省林業科學研究院
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年12月31日