一種中國被毛孢發酵培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物發酵領域，具體涉及一種中國被毛孢發酵培養方法。
【背景技術】
[0002] 中國被毛孢(Hirsutella sinensis)是從天然蟲草中分離得到的無性型蟲草菌 株。由于野生冬蟲夏草的稀缺性，現在人們大多采用人工方法分離和培育菌種來獲得冬蟲 夏草的替代品。雖然人工培育的蟲草菌絲體和天然野生的蟲草菌絲體在化學成分和藥效上 并不完全一樣，但是其活性成分仍然具有很高的藥效及經濟價值。如中國被毛孢是以生物 工程發酵而來，其作為冬蟲夏草替代品，以單方或復方的形式廣泛用于治療多種疾病，是食 藥兩用的保健品。
[0003] 由于天然冬蟲夏草具有嚴格的寄生性和特殊的地理生長環境，因而產量有限，加 上近年采挖過度，使得冬蟲夏草資源銳減，根本無法滿足保健和用藥的需求。所以采用現代 生物發酵技術深層發酵培養冬蟲夏草菌絲體是克服利用野生資源生物量受限的最佳途徑 和實現有用代謝產物開發利用的基礎。
[0004] 目前，中國被毛孢中的活性成分多采用傳統的提取、分離方法或者傳統發酵培養 方法得到，如中國專利ZL200710050273.7公開了一種中國被毛孢菌粉的生產方法，采用活 體蛋白培養基液體靜止發酵技術，活體蛋白培養基由下列重量百分比的原料制成：蛋70-90%，奶1-20%，馬鈴薯汁液1-5%，胡蘿卜汁液2-6% ;將上述培養基中的蛋、馬鈴薯、胡蘿卜 分別壓榨、離心、取汁、無菌過濾后與無菌過濾的奶按比例稱量混合均勻，裝入發酵容器中。 然后將中國被毛孢種液按培養基量的5-10 %為接種量接入發酵容器中，發酵容器中的氣、 液體積比為1-3 :1，可溶性蛋白質含量13-18 %，pH = 6-8，發酵車間溫度15-30°C，濕度30-60 %，培養7-10天干燥即得中國被毛孢菌粉。
[0005] 如今，為了得到營養特色不同和/或用途不同的中國被毛孢產品，人們開始對中國 被毛孢傳統的發酵方法進行改進或者創新，以期得到不同營養特色和/或不同用途的中國 被毛孢產品。例如：中國專利申請CN201310455400.7公開了一種用中國被毛孢發酵枸杞的 生產方法，主要應用于用中國被毛孢真菌發酵枸杞;包括如下步驟:步驟一:將30%-60%枸 杞和40 % -70 %乳按重量百分比制成培養基，置入培養容器，培養基占培養容器容積的1/ 10-7/10，在115-140°C濕熱滅菌30分鐘，接入占培養基重量0.5%-1 %的中國被毛孢菌種； 在15-22°C培養3-15天，培養基表面長滿菌絲，完成發酵過程;步驟二:將容器內物質干燥、 粉碎、過篩即得中國被毛孢發酵枸杞產品；其首次實現了中國被毛孢發酵枸杞的生產方法， 腎保健效果明顯，易于大規模工業化生產，是種綠色安全的生產方法。
[0006] 如能開發新的中國被毛孢培養技術及其產品，將可提高中國被毛孢的應用范圍及 應用價值。
【發明內容】
[0007] 本發明提供了一種中國被毛孢發酵培養組合物，該組合物中活性成分的含量和活 性高，具有良好的護肝功能。
[0008] 本發明還提供了一種中國被毛孢發酵培養方法，利用多種真菌發酵金鐵鎖和玉 竹，有助于提高最終產品中活性成分的含量和活性，得到具有護肝功能的組合物。
[0009] 本發明發現，根據中國被毛孢和米根霉的發酵特性，通過本發明特定的真菌發酵 及特定的工藝，能夠有效地將玉竹和金鐵鎖中的營養成分和有效成分進行生物降解和轉 化，有助于提尚最終廣品中活性成分的含量和活性。
[0010]本發明采用的技術方案是：
[0011] -種中國被毛孢發酵培養方法，包括步驟：
[0012] (1)取活化后的中國被毛孢菌種接種到液體MRS培養基中培養4天-15天，離心收集 第一菌體;將第一菌體懸浮在含膽鹽的液體MRS培養基中于18°C_30°C孵育lh-20h，離心收 集第二菌體;將第二菌體經PBS緩沖液清洗干凈后重新懸浮于液體MRS培養基中，震蕩搖勻 得到第二菌體液，將第二菌體液接種到含膽鹽的液體MRS培養基中于18°C_30°C再培養2天-20天，得到中國被毛孢種子液；
[0013] (2)取活化后的米根霉菌種接種到液體MRS培養基中培養3h-30h，離心收集第三菌 體，將第三菌體懸浮在含NaCl的液體MRS培養基中于20°C_30°C孵育0.5h-15h，離心收集第 四菌體;將第四菌體經PBS緩沖液清洗干凈后重新懸浮于液體MRS培養基中，震蕩搖勻得到 第四菌體液，將第四菌體液接種到含NaCl的液體MRS培養基中于20°C_30°C培養3h-30h，得 到米根霉種子液；
[0014] (3)將步驟(2)的米根霉種子液接入米根霉固態發酵培養基中，在20°c-30°c培養3 天-30天，然后置于交變磁場環境中再培養5天-20天，培養產物經真空冷凍干燥、粉碎后得 米根霉固態發酵產物;所述米根霉固態發酵培養基中含有金鐵鎖和玉竹；
[0015] ⑷將步驟⑶的米根霉固態發酵產物經亞臨界水萃取，得到米根霉發酵亞臨界萃 取物I，萃取后所剩的殘渣經真空冷凍干燥后得到萃取剩余物Π ;
[0016] (5)將步驟(1)的中國被毛孢種子液接入中國被毛孢液體發酵培養基中，調pH值為 3-7，在15°C_25°C培養5天-25天，離心，得到中國被毛孢發酵產物ΙΠ ;所述中國被毛孢液體 發酵培養基中含有萃取剩余物Π ;
[0017] 中國被毛孢發酵培養組合物為米根霉發酵亞臨界萃取物I和中國被毛孢發酵產物 m〇
[0018] 本發明進行米根霉固態發酵時，直接采用經含NaCl的液體MRS培養基兩步孵育處 理的米根霉種子液，并向培養基中添加玉竹和金鐵鎖，能夠有效地將其營養成分和有效成 分進行生物降解和轉化，有助于提高最終產品中活性成分的含量和活性。步驟(4)和步驟 (5)中，將米根霉固態發酵產物進行亞臨界水萃取，使萃取物中有效成分的活性得以最大程 度保留、含量得以大幅提高;再將萃取后的殘渣作為中國被毛孢液體發酵主要的培養基，且 采用經含膽鹽的液體MRS培養基兩步孵育處理的中國被毛孢種子液，通過一體化循環利用， 使各原料資源得到充分的利用，進一步提高了最終產品中活性成分的含量和活性。
[0019]為了達到更好的效果，優選：
[0020]步驟（1)中，所述含膽鹽的液體M R S培養基中膽鹽的質量百分含量為0.0 5 % -0.5%〇
[0021 ]所述第一菌體與用于懸浮第一菌體的含膽鹽的液體MRS培養基的體積比為1:1-3， 第二菌體與用于懸浮第二菌體的液體MRS培養基的體積比為1:1-3,第二菌體液的接種量為 5%〇
[0022]步驟(2)中，所述含NaCl的液體MRS培養基中NaCl的質量百分含量為0.5%-8%。 [0023]所述第三菌體與用于懸浮第三菌體的含NaCl的液體MRS培養基的體積比為1:1-3， 第四菌體與用于懸浮第四菌體的液體MRS培養基的體積比為1:1-3,第四菌體液的接種量為 3%〇
[0024]步驟（3)中，所述米根霉固態發酵培養基每1L中含有5.5g-8.5g金鐵鎖和0.2g-4.0g玉竹。所述米根霉固態發酵培養基由金鐵鎖、玉竹和發酵基礎培養基組成，所述發酵基 礎培養基采用本領域常規的發酵基礎培養基，可采用市售產品，也可采用現有配制方法配 制。所述金鐵鎖選用金鐵鎖根。所述玉竹選用玉竹根莖。
[0025]所述米根霉固態發酵培養基的制備方法，包括:將新鮮金鐵鎖、玉竹在自來水下沖 洗干凈，晾干，切碎;再將5.5g-8.5g金鐵鎖和0.2g-4.0g玉竹用發酵基礎培養基定容至1L， 混合均勻，pH值自然，得到米根霉固態發酵培養基。
[0026] 所述米根霉種子液的接入量為米根霉固態發酵培養基體積的5%_25%。
[0027]目前固態發酵普遍存在發酵周期長、菌絲生長萌發慢、特征次生代謝代謝產物含 量低等問題。本發明發現將交變磁場處理技術應用于固態發酵中，通過特定培養時期的適 當處理等外界因素有效刺激，提高真菌菌絲的生長代謝，縮短發酵時間，有效促進次生代謝 產物的生成。所述交變磁場環境中磁場強度為0.2mT-6mT，磁場頻率為3Hz-40Hz。
[0028] 步驟（4)中，所述亞臨界水萃取的條件為：水料質量比為10-50:1，萃取壓力在 4MPa-25MPa，萃取溫度為100°C_180°C，萃取時間為10min-90min。
[0029] 步驟(5)中，所述中國被毛孢液體發酵培養基每1L中含有0.2g_lg萃取剩余物Π 。 所述中國被毛孢液體發酵培養基由萃取剩余物Π 和發酵基礎培養基組成，所述的發酵基礎 培養基采用本領域常規的發酵基礎培養基，可采用市售產品，也可采用現有配制方法配制。
[0030] -般發酵基礎培養基由以下質量百分比的組分組成：葡萄糖1 %-3 %、 K2HPO4O · 1 %-0 · 2%、MgS〇4〇 · 05%-0 · 1 % 和余量的水。
[0031]所述中國被毛孢液體發酵培養基的制備方法，包括:將0.2g_lg萃取剩余物Π 用發 酵基礎培養基定容至1L，混合均勻，pH值自然，得到中國被毛孢液體發酵培養基。
[0032] 所述中國被毛孢種子液的接入量為中國被毛孢液體發酵培養基體積的3%_20%。
[0033] 所述中國被毛孢菌種可采用現有任意一種中國被毛孢菌種，可采用市售產品，例 如：中國被毛孢(Hirsutella sinensis)菌種，購于北京北納創聯生物技術研究院。
[0034] 所述米根霉菌種可采用現有任意一種米根霉菌種，可采用市售產品，例如:米根霉 (Rhizopus oryzae)ACCC 30416菌種，購于中國農業微生物菌種保藏管理中心。
[0035] 所述液體MRS培養基采用本領域常規的液體MRS培養基，可采用市售產品，也可采 用現有配制方法配制。一般液體MRS培養基的組成為:蛋白胨10.0g、牛肉浸膏10.0g、酵母浸 膏5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸鈉5.0g、檸檬酸氫二銨2.0g、吐溫-80 1.0ml、磷酸氫二鉀2.0g、 硫酸鎂〇. 2g、硫酸錳0.05g和蒸餾水1.0升。
[0036]所述PBS緩沖液即磷酸緩沖鹽溶液，采用本領域常規的PBS緩沖液，可采用市售產 品，也可采用現有配制方法配制。一般1L PBS緩沖液:磷酸二氫鉀0.27g、磷酸氫二鈉1.42g、 氯化鈉8g和氯化鉀0.2g，加適量去離子水充分攪拌溶解，然后加入濃鹽酸調p