組織進(jìn)行低溫冷凍，將 低溫凍結(jié)的組織樣品稱量后轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨組織，其間不斷加入 液氮，直至研磨成粉末狀;加入lml RNAiso Plus(寶生物公司）；
[0140] ②將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中；
[0141] ③向勻漿裂解液中加入氯仿，緊蓋離心管蓋，混合至溶液乳化呈乳白色；
[0142] ④室溫靜置5分鐘；
[0143] ⑤在4°C條件下離心15分鐘，從離心機(jī)中取出離心管，此時(shí)勻漿液分為三層，即：無 色的上清液(含RNA)、中間的白色蛋白層(大部分為DNA)及帶有顏色的下層有機(jī)相；
[0144] ⑥吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)離心管中，向上清液中加入0.5倍RNAiso Plus體積的 異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，室溫下靜置10分鐘；
[0145] ⑦4°C條件下離心10分鐘；
[0146] 2)RNA沉淀的清洗
[0147] 棄去上清，加入與RNAiso Plus等量的75%乙醇，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁， 在4°C條件下離心5分鐘后小心棄去上清；
[0148] 3)RNA 的溶解
[0149] 打開離心管蓋，室溫干燥沉淀，沉淀干燥后，加入RNase-free水溶解沉淀，最后將 RNA溶液貯存于_80°C;
[0150] 4)總RNA純度、濃度及完整性檢測(cè)
[0151] 取lyL總RNA溶于99yL無 RNase水中，用蛋白質(zhì)核酸檢測(cè)儀測(cè)總RNA在0D260nm、 0D280nm的吸光值，并求出兩者的的比值；
[0152] 5)總RNA電泳檢測(cè)
[0153] 取3yL總RNA樣品經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳20min后，在凝膠紫外線投射儀下觀察電泳 結(jié)果；
[0154] 6)PCR引物設(shè)計(jì)
[0?55] 根據(jù)GenBanK中原雞(Gallus gallus)的相關(guān)基因序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件primer 5.0設(shè)計(jì)引物，并合成，合成后用熒光定量PCR，PCR引物設(shè)計(jì)中用于熒光定量的LEAP-2基因 的引物序列為：
[0156] F:5 '-GGCATTCCTTTTATTCTTCTCGC-3 '；
[0157] R:5 '-TGCATTCACTGTTATCCCTACA-3 '
[0158] 內(nèi)參18S rRNA的引物序列為：
[0159] F:TGGACTCCTACAACCAACGG
[0160] R：CATCCTCCTTGAACTCGCAG
[0161] 熒光定量PCR的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性2min; 95°C變性15s，65°C退火30s、72°C延 伸30s，40個(gè)循環(huán)；
[0162] 7)檢測(cè)LEAP-2基因的表達(dá)量
[0163] 表4大圍山微型雞在4周齡、8周齡和12周齡LEAP-2基因在肝臟、脾臟、胸腺和法氏 囊中的表達(dá)
[0164]
[0165] 實(shí)施例5
[0166] 對(duì)武定雞、鹽津?yàn)豕请u、茶花雞、大圍山微型雞四個(gè)雞種在4周齡、8周齡和12周齡 的沙門氏菌感染率進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖5所示，四個(gè)品種在4周齡的感染率分別為:4.4%、 3.0%、1.54%、0.88% ;8周齡的感染率分別為：2.67%、1.76%、1.02%、0.64%;12周齡的 感染率分別為:2·56%、1·53%、0·74%、0·43%。
[0167] 本發(fā)明對(duì)抗菌肽LEAP-2基因設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)LEAP-2基因 mRNA在云南 地方雞在肝臟、脾臟、胸腺和法式囊四個(gè)組織的表達(dá)量，在肝臟、脾臟、胸腺、法氏囊四個(gè)組 織中表達(dá)量高的云南地方雞不容易遭受環(huán)境變化、病原微生物感染，在肝臟、脾臟、胸腺、法 氏囊四個(gè)組織中的表達(dá)量低的云南地方雞免疫機(jī)能較強(qiáng)，對(duì)云南地方雞優(yōu)良品種的相關(guān)基 因進(jìn)行研究，不但可以進(jìn)一步了解云南地方雞種抗病力強(qiáng)的原因，為揭示云南地方雞抗病 力遺傳特性提供理論依據(jù)，而且可以對(duì)云南地方雞雞種品質(zhì)資源的保護(hù)、利用和創(chuàng)新起到 積極的作用，并指導(dǎo)地方雞種的雜交改良、品種(系）的培育，為雞抗逆生理機(jī)制和抗病育種 研究提供參考。
[0168] 以上對(duì)本發(fā)明實(shí)施例所提供的進(jìn)行了詳細(xì)介紹基于LEAP-2基因判斷云南地方雞 抗病能力強(qiáng)弱的方法，本文中應(yīng)用了具體個(gè)例對(duì)本發(fā)明的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，但 不僅僅限定于上述四個(gè)雞種，對(duì)云南地方雞的抗病能力的強(qiáng)弱都能夠判斷，最后選擇最優(yōu) 的品種，以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想；同時(shí)，對(duì)于本領(lǐng) 域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的思想，在【具體實(shí)施方式】及應(yīng)用范圍上均會(huì)有改變之處，綜 上所述，本說明書內(nèi)容不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于LEAP-2基因判斷云南地方雞抗病能力強(qiáng)弱的方法，其特征在于：具體包括 以下步驟： 1)RNA的提取 ① 選取同一批次出殼的云南地方雞的健康雞只120只進(jìn)行隔離飼養(yǎng)，分別于4、8、12周 齡屠宰，采集各個(gè)雞只的肝臟、脾臟、胸腺、法氏囊組織，將采集的組織進(jìn)行低溫冷凍，將低 溫凍結(jié)的組織樣品稱量后轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨組織，其間不斷加入液 氮，直至研磨成粉末狀;加入RNAisoPlus; ② 將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中； ③ 向勻漿裂解液中加入RNAisoPlus體積量1/5的氯仿，緊蓋離心管蓋，混合至溶液乳 化呈乳白色； ④ 室溫靜置5分鐘； ⑤ 在4°C條件下離心15分鐘，從離心機(jī)中取出離心管，此時(shí)勻漿液分為三層，S卩：無色的 含RNA上清液、中間的含DNA的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機(jī)相； ⑥ 吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)離心管中，向上清液中加入0.5-1倍RNAisoPlus體積的異 丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，室溫下靜置10分鐘； ⑦ 4°C條件下離心10分鐘； 2)RNA沉淀的清洗 棄去上清液，加入與RNAisoPlus等量的75%乙醇，上下顛倒洗滌離心管管壁，在4°C條 件下離心5分鐘后小心棄去上清液； 3)RNA的溶解 打開離心管蓋，室溫干燥沉淀，沉淀干燥后，加入RNase-free水溶解沉淀，最后將RNA溶 液貯存于_80°C; 4) 總RNA純度、濃度及完整性檢測(cè) 取lyL總RNA溶于99yL無RNase水中，用蛋白質(zhì)核酸檢測(cè)儀測(cè)總RNA在0D260nm、0D280nm的吸光值，并求出兩者的的比值； 5) 總RNA電泳檢測(cè) 取3yL總RNA樣品經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳20min后，在凝膠紫外線投射儀下觀察電泳結(jié) 果； 6)PCR引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBanK中原雞(Gallusgallus)的相關(guān)基因序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件primer5.0 設(shè)計(jì)引物，并合成，合成后進(jìn)行熒光定量PCR;引物序列為？:5'-660六17〇：1'1'1741'1'(：1'1'(：1^6(：-3 '；R:5 '-TGCATTCACTGTTATCCCTACA-3 '； 7) 檢測(cè)LEAP-2基因的表達(dá)量 檢測(cè)云南四個(gè)地方雞種肝臟、脾臟、胸腺、法氏囊四個(gè)組織中LEAP-2基因的表達(dá)量，熒 光定量PCR的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性2min;95°C變性15s，65°C退火30s、72°C延伸30s，40個(gè) 循環(huán)。2. 根據(jù)權(quán)利1所述的一種基于LEAP-2基因判斷云南地方雞抗病能力強(qiáng)弱的方法，其特 征在于:在步驟1)總RNA的提取①中加入RNAisoPlus的量為lml。3. 根據(jù)權(quán)利1所述的一種基于LEAP-2基因判斷云南地方雞抗病能力強(qiáng)弱的方法，其特 征在于:在步驟1)總RNA的提?、壑屑尤隦NAisoPlus體積量1 /5的氯仿。4. 根據(jù)權(quán)利1所述的一種基于LEAP-2基因判斷云南地方雞抗病能力強(qiáng)弱的方法，其特 征在于：在步驟1)總RNA的提?、葜腥芤悍謱訛槿龑樱龑臃謩e為:無色含RNA的上清液、白 色的中間蛋白層及帶有顏色的下層有機(jī)相。5. 根據(jù)權(quán)利1所述的一種基于LEAP-2基因判斷云南地方雞抗病能力強(qiáng)弱的方法，其特 征在于:步驟6)PCR引物設(shè)計(jì)中用于熒光定量的LEAP-2基因的引物序列為： F:5 '-GGCATTCCTTTTATTCTTCTCGC-3 ' R:5 '-TGCATTCACTGTTATCCCTACA-3 ' 內(nèi)參18SrRNA的引物序列為： F:5 '-TGGACTCCTACAACCAACGG-3 ' R:5 '-CATCCTCCTTGAACTCGCAG-3 ' 熒光定量PCR的反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性2min; 95°C變性15s，65°C退火30s、72°C延伸 30s，40個(gè)循環(huán)。6. 根據(jù)權(quán)利1所述的一種基于LEAP-2基因判斷云南地方雞抗病能力強(qiáng)弱的方法，其特 征在于:所述的云南地方雞包括武定雞、鹽津?yàn)豕请u、茶花雞、大圍山微型雞。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于LEAP-2基因判斷云南地方雞抗病能力強(qiáng)弱的方法，屬于動(dòng)物分子育種的基因工程技術(shù)領(lǐng)域；所述的基于LEAP-2基因判斷云南地方雞抗病能力強(qiáng)弱的方法包括以下具體步驟為：1）總RNA的提??；2）RNA沉淀的清洗；3）RNA的溶解；4）總RNA純度、濃度及完整性檢測(cè)；5）總RNA電泳檢測(cè)；6）PCR引物設(shè)計(jì)；7）檢測(cè)LEAP-2基因的表達(dá)量來基于LEAP-2基因判斷云南地方雞抗病能力的強(qiáng)弱，在肝臟、脾臟、胸腺、法氏囊四個(gè)組織中的表達(dá)量高的云南地方雞不容易遭受環(huán)境變化影響和被病原微生物感染，在脾臟、胸腺、法氏囊三個(gè)組織中的表達(dá)量高的云南地方雞免疫機(jī)能較強(qiáng)。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105483247
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201511017340
【發(fā)明人】劉麗仙, 李琦華, 榮華, 趙筱, 李正田, 徐志強(qiáng), 谷大海, 曹振輝, 豆騰飛, 佟薈全, 林秋葉, 賈俊靜, 汪善榮, 葛長(zhǎng)榮
【申請(qǐng)人】云南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年4月13日
【申請(qǐng)日】2015年12月29日