一種基于leap-2基因判斷云南地方雞抗病能力強弱的方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于動物分子育種的基因工程技術領域，具體涉及一種基于LEAP-2基因判 斷云南地方雞抗病能力強弱的方法。
【背景技術】
[0002] 免疫抗病研究是現代家禽育種研究的一大熱點。家禽的品種、養殖環境、飼料等都 會在實際生產過程中對禽類的抗病力產生影響，但禽類機體自身固有免疫代謝能力在機體 抗病效應中的表現中有著舉足輕重的地位。所以，準確認識動物機體免疫器官在不同時間 階段免疫相關基因的表達特性，是免疫抗病研究的基礎。
[0003] 抗菌肽是生物體產生的一種具有抗菌活性的多肽，是機體先天免疫系統中防御病 菌入侵的重要成分。Π 型肝表達抗菌肽(Liver expressed antimicrobial peptide 2， LEAP-2)是近年來在脊椎動物中發現的一種新型抗菌肽，其氨基酸序列、二級結構及表達模 式等與已知肽類均不相同，并具有較強的抗微生物活性。LEAP-2基因編碼94個氨基酸殘基 組成的多肽;氨基端的信號肽由28個殘基組成，成熟肽含有41個殘基。人LEAP-2基因包含3 個外顯子和2個內含子，只有1個拷貝。通過放射性雜交作圖發現LEAP-2基因位于5號染色體 的長臂3區1帶，編碼77個氨基酸殘基組成的前體蛋白質，多分布于肝臟。鼠類LEAP-2基因也 是由3個外顯子和2個內含子組成的。Northern印跡分析確認肝和小腸是鼠表達LEAP-2的主 要器官。在雞體內分離得到的LEAP-2是首次發現于非哺乳動物的LEAP-2，它含有76個氨基 酸殘基，與人的LEAP-2序列有59%同源性，C端含有2對二硫鍵，該基因位于第13號染色體， 有3個外顯子和2個內含子。LEAP-2作為抗菌肽的一種，對保護禽類免受微生物影響具有重 要作用，它能通過破壞細胞膜，干擾代謝等方式殺死細菌、真菌、寄生蟲、病毒等，并在先天 性免疫中通過調節趨化因子和細胞因子的活性發揮作用。
【發明內容】
[0004] 本發明提供一種基于LEAP-2基因判斷云南地方雞抗病能力強弱的方法，采用分子 生物學技術和生物信息學分析方法，在對云南地方雞LEAP-2基因 mRNA表達量的研究中發現 LEAP-2基因與免疫功能相關，通過云南地方雞LEAP-2基因 mRNA在云南地方雞的肝臟、脾臟、 胸腺、法氏囊四個組織中的表達量，判斷云南地方雞免疫機能的強弱，在肝臟、脾臟、胸腺、 法氏囊四個組織中的表達量高的云南地方雞不容易遭受環境變化和被病原微生物感染，在 肝臟、脾臟、胸腺、法氏囊四個組織中的表達量高的云南地方雞免疫機能較強。
[0005] 為了達到上述目的，本發明提出如下技術方案：
[0006] 所述的基于LEAP-2基因判斷云南地方雞抗病能力強弱的方法包括以下具體步驟 為：
[0007] 1)RNA 的提取
[0008] ①選取同一批次出殼的四個品種(武定雞、鹽津烏骨雞、茶花雞、大圍山微型雞)健 康雞只120只進行隔離飼養，分別于4、8、12周齡屠宰，采集各個雞只的肝臟、脾臟、胸腺、法 氏囊組織，將采集的組織進行低溫冷凍，將低溫凍結的組織樣品稱量后轉移至用液氮預冷 的研缽中，用研件研磨組織，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀;加入lml RNAiso Plus (寶生物公司）。
[0009] ②將勻漿液轉移至離心管中；
[0010] ③向勻漿裂解液中加入RNAiso Plus體積量1/5的氯仿，緊蓋離心管蓋，混合至溶 液乳化呈乳白色；
[0011] ④室溫靜置5分鐘；
[0012]⑤在4°C條件下離心15分鐘，從離心機中取出離心管，此時勾衆液分為三層，即：無 色的上清液(含RNA)、中間的白色蛋白層(大部分為DNA)及帶有顏色的下層有機相；
[0013] ⑥吸取上清液轉移至另一個離心管中，向上清液中加入0.5-1倍RNAiso Plus體積 的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，室溫下靜置10分鐘；
[0014] ⑦4°C條件下離心10分鐘；
[0015] 2)RNA沉淀的清洗
[0016]棄去上清，加入與RNAiso Plus等量的75%乙醇，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁， 在4°C條件下離心5分鐘后小心棄去上清；
[0017] 3)RNA 的溶解
[0018] 打開離心管蓋，室溫干燥沉淀，沉淀干燥后，加入RNase-free水溶解沉淀，最后將 RNA溶液貯存于-80°C;
[0019] 4)總RNA純度、濃度及完整性檢測
[0020] 取lyL總RNA溶于99yL無 RNase水中，用蛋白質核酸檢測儀測總RNA在0D260nm、 0D280nm的吸光值，并求出兩者的的比值；
[0021] 5)總RNA電泳檢測
[0022]取3yL總RNA樣品經1%瓊脂糖凝膠電泳20min后，在凝膠紫外線投射儀下觀察電泳 結果；
[0023] 6)PCR引物設計
[0024] 根據GenBanK中原雞(Gallus gallus)的相關基因序列，使用引物設計軟件primer 5.0設計引物，并合成，合成后用熒光定量PCR;
[0025] 7)檢測LEAP-2基因的表達量
[0026] 檢測云南地方雞肝臟、脾臟、胸腺、法氏囊四個組織中LEAP-2基因的表達量。
[0027] 進一步，其特征在于:在步驟1)總RNA的提取①中加入lml RNAiso Plus(寶生物公 司）。
[0028] 進一步，在步驟1)總RNA的提取③中加入RNAiso Plus體積量1/5的氯仿。
[0029]進一步，在步驟1)總RNA的提取⑤中溶液分層為三層，三層分別為:無色含RNA的上 清液、白色的中間蛋白層及帶有顏色的下層有機相。
[0030] 進一步，步驟6) PCR引物設計中用于熒光定量的LEAP-2基因的引物序列為：
[0031] F:5 '-GGCATTCCTTTTATTCTTCTCGC-3 '；
[0032] R:5 '-TGCATTCACTGTTATCCCTACA-3 '
[0033] 內參18S rRNA的引物序列為：
[0034] F:5 '-TGGACTCCTACAACCAACGG-3 '
[0035] R:5 '-CATCCTCCTTGAACTCGCAG-3 '
[0036] 熒光定量PCR的反應條件為:95°C預變性2min; 95°C變性15s，65°C退火30s、72°C延 伸30s，40個循環。
[0037] 進一步，所述的云南地方雞包括武定雞、鹽津烏骨雞、茶花雞、大圍山微型雞。
[0038]本發明的有益效果：
[0039] 本發明對抗菌肽LEAP-2基因設計引物，進行PCR擴增，檢測LEAP-2基因 mRNA在云南 地方雞在肝臟、脾臟、胸腺和法式囊四個組織的表達量，在肝臟、脾臟、胸腺、法氏囊四個組 織中表達量高的云南地方雞更容易遭受環境變化、病原微生物感染，在肝臟、脾臟、胸腺、法 氏囊四個組織中的表達量高的云南地方雞免疫機能較強，對云南地方雞優良品種的相關基 因進行研究，不但可以進一步了解云南地方雞種抗病力強的原因，為揭示云南地方雞抗病 力遺傳特性提供理論依據，而且可以對云南地方雞雞種品質資源的保護、利用和創新起到 積極的作用，并指導地方雞種的雜交改良、品種(系）的培育，為雞抗逆生理機制和抗病育種 研究提供參考。
【附圖說明】
[0040] 圖1是本發明的LEAP-2基因在四個云南地方雞種肝臟中的表達比較分析圖；
[0041] 圖2是本發明的LEAP-2基因在四個云南地方雞種脾臟中的表達比較分析圖；
[0042]圖3是本發明的LEAP-2基因在四個云南地方雞種胸腺中的表達比較分析圖；
[0043]圖4是本發明的LEAP-2基因在四個云南地方雞種法氏囊中的表達比較分析圖；
[0044]圖5是本發明的LEAP-2基因在四個云南地方雞種沙門氏菌病感染率比較分析圖。
【具體實施方式】
[0045]如圖1-5所示，下面將結合本發明的實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清 楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例， 基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有 其它實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[0046] 實施例1
[0047] 一種基于LEAP-2基因判斷云南地方雞抗病能力強弱的方法，包括以下具體步驟 為：
[0048] 1)RNA 的提取
[0049] ①選取同一批次出殼的武定雞健康雞只120只進行隔離飼養，分別于4、8、12周齡 屠宰，采集各個雞只的肝臟、脾臟、胸腺、法氏囊組織，將采集的組織進行低溫冷凍，將低溫 凍結的組織樣品稱量后轉移至用液氮預冷的研缽中，用研杵研磨組織，其間不斷加入液氮， 直至研磨成粉末狀;加入lml RNAiso Plus(寶生物公司）。
[0050] ②將勻漿液轉移至離心管中；
[0051] ③向勻漿裂解液中加入氯仿，緊蓋離心管蓋，混合至溶液乳化呈乳白色；
[0052]④室溫靜置5分鐘；
[0053]⑤在4°C條件下離心15分鐘，從離心機中取出離心管，此時勻漿液分為三層，即：無 色的上清液(含RNA)、中間的白色蛋白層(大部分為DNA)及帶有顏色的下層有機相；
[0054] ⑥吸取上清液轉移至另一個離心管中，向上清液中加入1倍RNAiso Plus體積的異 丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，室溫下靜置10分鐘；
[0055] ⑦4°C條件下離心10分鐘；
[0056] 2)RNA沉淀的清洗
[0057