[0024] 進一步，該PCR試劑盒適合于目前存在市場上的所有類型熒光定量基因擴增儀，靈 敏度高，定量快速準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好，具有良好的應(yīng)用前景。
[0025] 進一步，上述熒光定量PCR試劑盒組分包括:特異性引物、內(nèi)參引物、焚光定量PCR 反應(yīng)液。其中所述的特異性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQ ID N0.1， 下游引物序列為SEQ ID NO. 2。所述內(nèi)參引物為β-actin內(nèi)參引物，上游引物序列為SEQ ID NO.3,下游引物序列為SEQ ID NO.4。
[0026] 本發(fā)明目的是提供了一種口腔癌檢測試劑盒，所述的檢測試劑盒檢測LRRC26蛋 白。進一步的，所述的試劑盒還包括其他檢測試劑。
[0027] 本發(fā)明目的是提供了一種檢測口腔癌的基因芯片，所述的基因芯片包括與LRRC26 基因的核酸序列雜交的探針。
【附圖說明】
[0028] 圖1 RT-PCR檢測癌組織LRRC26基因表達情況
[0029] 圖2轉(zhuǎn)染過表達載體后口腔癌細胞生長曲線
【具體實施方式】
[0030] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本 發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解:在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可 以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限 定。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條 件實施檢測。
[0031 ] 實施例1
[0032]收集口腔癌及正常組織，對其進行分組及編號：3例正常組織塊(編號為N1、N2、N3) 和2例癌組織塊、癌旁組織塊(Cl、C2和PI、P2)。
[0033]對三組樣品進行RNA提取，RNA提取后瓊脂糖凝膠電泳。從電泳結(jié)果初步認(rèn)為提取 的RNA樣品質(zhì)量合格，可以用于進一步的轉(zhuǎn)錄組分析。進而通過NanoDroplOOO分光光度計檢 測RNA樣品的提取情況，結(jié)果如表1所示。每個樣品體積均為SOyl^NA-seq測序的樣品要求： 0D260/0D280為 1.8-2.2。1?預(yù)0· integrity number)指的是RNA完整性指數(shù)，是RNA質(zhì)量的 重要指標(biāo)。從表1可以看出，本研究的樣品均達到轉(zhuǎn)錄組測序的要求。
[0034] 表1 口腔癌RNA樣品的分光光度檢測
[0035]
[0036] 實施例2高通量轉(zhuǎn)錄組測序及分析
[0037] 測序平臺：Illumina公司的HiSeq 2500高通量測序平臺
[0038] 轉(zhuǎn)錄組測序和匹配：
[0039] 我們進行分析的癌變組織、癌旁組織及正常組織3組樣品來自于2例口腔癌患者和 3例健康人群。將這兩組樣品進行高通量cDNA測序。從這3個組織中我們分別得到4.85 X 107，4.91 X 107，4.46 X 107個讀段對。我們利用TopHat將讀段匹配到UCSC參考人基因組 (hgl9)，唯一匹配的讀段對范圍在4.04 X 107到4.49 X 107之間，匹配到Ensembl參考基因的 讀段比例在81%到89%之間。我們測序深度的平均覆蓋度大概為人類基因組的130倍(按照 Ensembl數(shù)據(jù)庫唯一注釋的外顯子區(qū)域的總長度，約為1.13X108)，另外只有1%的讀段定 位至IjrRNA，表明我們的數(shù)據(jù)庫構(gòu)建合理，較可靠地表現(xiàn)帶有ployA尾巴的RNA的表達。
[0040] 差異表達基因的分析：
[0041] 為了計算基因的表達從而鑒定出不同樣品間的差異表達基因，我們利用Cuffdiff 方法估計基因的表達，從而鑒定表達失調(diào)的基因。每個基因的標(biāo)準(zhǔn)化的表達水平按照每一 百萬測序片段中匹配到特定基因 lkb長的外顯子區(qū)域的片段數(shù)目（FPKM)計算。
[0042] 差異表達基因的功能富集分析:為了更好的理解差異表達基因的功能，我們對表 達失調(diào)的基因進行Gene Ontology的功能富集分析。為了鑒別癌癥特異的功能目錄，我們利 用在線工具DAVID比較癌變組織、正常組織和癌變組織、癌旁組織的表達顯著變化的基因進 行功能富集分析。
[0043]候選基因的選擇:從上述RNA-seq測序及深度分析結(jié)果中篩選差異表達基因的候 選基因（正常組VS癌變組，癌旁組VS癌變組），排序依據(jù)為p-value大小，LRRC26基因進入我 們的研究視野。
[0044] 實施例3癌組織、癌旁組織及正常組織LRRC26基因表達情況
[0045] 一材料和方法 [0046] 1、材料
[0047] 口腔癌自于2010年-2014年住院病例，分別取49例口腔癌患病病人的癌組織、癌旁 組織和23例健康人群正常組織做對照。
[0048] 2、方法
[0049] 2.1 口腔癌組、癌旁組及正常組總RNA的提取
[0050] 按康為世紀(jì)超純RNA提取試劑盒(Ultrapure RNA Kit(DNase I)，貨號CW0597)說 明書提取口腔癌組及正常組的RNA，通過凝膠電泳證明RNA的完整性，用核酸蛋白儀測定RNA 的濃度和純度。
[0051 ] 采用超純RNA提取試劑盒(貨號CW0597)提取，主要操作步驟如下：
[0052] 1.樣品處理，30-50mg組織在液氮中充分研磨后加入lml Buffer RLT，或在組織樣 品中加入lml Buffer RLT后勻漿處理。
[0053] 2.樣品中加入Buffer RLT后反復(fù)吹打幾次，使樣本充分裂解。室溫放置5分鐘，使 蛋白核酸復(fù)合物完全分離。
[0054] 3.以每lml Buffer RLT加入200μ1氯仿的比例加入氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15 秒，室溫放置2分鐘。
[0055] 4. 4°C12，000rpm離心10分鐘，此時樣品分為三層:紅色有機相，中間層和上層無 色水相，RNA主要在上層水相中，將上層水相移到一個新的RNase-Free離心管（自備）中。 [0056] 5.在得到的水相溶液中加入等體積的70 %乙醇(無 RNase的水配制），顛倒混勻。
[0057] 6.將上步所得溶液全部加入到已裝入收集管（Collection Tube 2ml)的吸附柱 (Spin Column RM)中。若一次不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入。12,OOOrpm離心20秒，倒掉收集 管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
[0058] 7.向吸附柱中加入350μ1 Buffer RWl，12,000rpm離心20秒，倒掉收集管中的廢 液，將吸附柱重新放回收集管中。
[0059] 8.配制DNase I混合液：取52μ1 RNase-Free Water，向其中加入8μ110 XReaction Buffer和20μ1 DNase KlU/μΙ)，混勻，配制成終體積為80μ1的反應(yīng)液。
[0060] 9.向吸附柱中直接加入80μ1 DNase I混合液，20-30°C孵育15分鐘。
[0061] 10.向吸附柱中加入350μ1 Buffer RWl，10,000rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱 重新放回收集管中。
[0062] 11.向吸附柱中加入500μ1 Buffer RW2(使用前檢查是否已加入無水乙醇），12， OOOrpm離心20秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
[0063] 12.重復(fù)步驟11。
[0064] 13. 12,000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘，以徹 底晾干。
[0065] 14.將吸附柱置于一個新的無 RNase離心管(Collection Tube 1.5ml)中，向吸附 柱的中間部位加入30_50μ1 RNase-Free Water，室溫放置1分鐘，12，OOOrpm離心1分鐘，收 集RNA溶液，-70°C保存RNA，防止降解。
[0066] 15.總1?^完整性鑒定:取2以11?熟樣品在1.5%瓊脂糖凝膠電泳(8(^，151^11)，分出 區(qū)帶后，EB染色，紫外燈下觀察電泳區(qū)帶。
[0067] 16.用核酸蛋白儀測定RNA的濃度和純度。
[0068] 2.2 LRRC26檢測引物設(shè)計與合成
[0069] 根據(jù)PCR引物設(shè)計原則，應(yīng)用Premier 5.0和增強版的OligoArchitect?軟件進