基因的差異表達在口腔癌診斷中的應用
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及生物工程技術領域，具體地，涉及基因的差異表達在口腔癌診斷中的 應用，更具體的涉及LRRC26基因的差異表達在口腔鱗狀細胞癌診斷中的應用。
【背景技術】
[0002] 口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，0SCC)是口腔領面部最為常見 的惡性腫瘤，根據國際抗癌聯盟/美國腫瘤研究聯合委員會(UICC/AJCC)分級，腫瘤早期（I、 II)通過手術治療預后良好，但許多患者發現時即為腫瘤晚期（III、IV)或已出現無法治療 的局部復發。口腔位于消化道和呼吸道的起始位置，重要器官密集，且位于顏面部，故而在 臨床實踐工作中對于腫瘤晚期和復發轉移患者無法按"無瘤原則"進行徹底的根治性手術， 盡管輔以多種治療手段，其五年生存率近年來任沒有明顯增加。近年來隨著遺傳學與分子 生物學的蓬勃發展，通過對口腔鱗癌發生發展的分子機制的研究，尤其是對癌變過程中關 鍵性基因的篩選及靶向治療的轉化研究，為口腔鱗癌提供一種新的治療方法以補充甚至替 代現有的治療手段。
[0003] 發明人通過高通量測序平臺選取2例口腔鱗狀細胞癌癌組織、癌旁組織及3例正常 組織的轉錄組深度測序分析，初步篩選出在口腔鱗狀細胞癌組織、癌旁組織和正常組織中 差異表達明顯的基因 LRRC26,進一步RT-PCR實驗證實了LRRC26基因與口腔鱗狀細胞癌組織 低表達，LRRC26與口腔鱗狀細胞癌具有很好的相關性，可用于制備口腔鱗狀細胞癌輔助診 斷或者預后制劑，具有重要的臨床實際應用價值。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種治療口腔癌制劑，所述治療口腔癌制劑促進LRRC26基 因的表達。
[0005] 本發明的目的在于提供促進LRRC26基因和/或LRRC26蛋白表達的試劑在制備口腔 癌治療制劑中的應用。
[0006] 進一步，口腔癌治療制劑中含有促進LRRC26基因表達的載體。
[0007 ]進一步，口腔癌治療制劑是指可以促進LRRC26基因的表達的制劑。本領域人員熟 知促進基因的表達通常可以采用下述方法中的一種和/或幾種：通過DNA水平調控目的基 因：包括但不限于增加 LRRC26基因的拷貝數、轉染含LRRC26基因的過表達載體;通過轉錄水 平調控LRRC26基因：包括但不限于激活LRRC26基因的表達、激活調控LRRC26基因表達的啟 動子、抑制負調控LRRC26基因表達的轉錄因子、采用RNA干擾技術對抑制LRRC26基因表達的 抑制子進行干擾；通過轉錄后水平調控LRRC26基因：包括但不限于抑制促進LRRC26基因 mRNA降解的microRNA轉錄表達、導入促進LRRC26基因表達的microRNA;通過翻譯后水平調 控LRRC26基因：包括但不限于導入促進目的基因編碼蛋白的分子、抑制負調控LRRC26基因 表達的蛋白、促進LRRC26基因表達的因子及蛋白的表達。
[0008]進一步，口腔癌治療制劑會抑制口腔癌細胞增殖。
[0009] 本發明的目的在于提供檢測LRRC26基因和/其表達產物的試劑在制備口腔癌診斷 劑中的應用。
[0010] 進一步，所述口腔癌為口腔鱗狀細胞癌。
[0011] 為實現上述目的，本發明首先通過高通量測序結合生物信息學方法篩選到候選基 因 LRRC26，進一步通過分子生物學方法驗證了 LRRC26與口腔癌的關系：LRRC26在口腔癌患 者中低表達，與口腔癌具有很好的相關性，可用于制備治療口腔癌制劑和/或口腔癌診斷制 劑，具有重要的臨床應用價值。
[0012] 本發明的目的在于提供LRRC26基因在制備口腔癌診斷制劑中的應用。
[0013] 進一步，所述的口腔癌的診斷制劑包括用熒光定量PCR方法、基因芯片方法檢測口 腔癌患者組織中LRRC26基因的表達。
[0014] 熒光定量PCR法是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記 跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的 初始濃度。熒光定量PCR的出現，極大地簡化了定量檢測的過程，而且真正實現了絕對定量。 多種檢測系統的出現，使實驗的選擇性更強。自動化操作提高了工作效率，反應快速、重復 性好、靈敏度高、特異性強、結果清晰。
[0015] 基因芯片又稱為DNA微陣列（DNA microarray)，可分為三種主要類型：1)固定在聚 合物基片(尼龍膜，硝酸纖維膜等)表面上的核酸探針或cDNA片段，通常用同位素標記的靶 基因與其雜交，通過放射顯影技術進行檢測。2)用點樣法固定在玻璃板上的DNA探針陣列， 通過與熒光標記的靶基因雜交進行檢測。3)在玻璃等硬質表面上直接合成的寡核苷酸探針 陣列，與熒光標記的靶基因雜交進行檢測。基因芯片作為一種先進的、大規模、高通量檢測 技術，應用于疾病的診斷，其優點有以下幾個方面:一是高度的靈敏性和準確性;二是快速 簡便;三是可同時檢測多種疾病。
[0016 ]所述的用于焚光定量PCR方法檢測口腔癌中LRRC26基因的產品含有一對特異性擴 增LRRC26基因的引物;所述的基因芯片包括與LRRC26基因的核酸序列雜交的探針。
[0017] 所述的用于焚光定量PCR方法檢測口腔癌中LRRC26基因的產品可以檢測癌組織與 癌旁組織中LRRC26基因的表達，也可以檢測癌組織與正常組織中LRRC26基因的表達。
[0018] 本發明的目的在于提供LRRC26基因表達產物在制備口腔癌診斷制劑中的應用。進 一步，所述的口腔癌的診斷制劑包括用免疫方法檢測LRRC26蛋白的表達。優選所述免疫檢 測方法檢測口腔癌中LRRC26蛋白表達的為western blot和/或ELISA和/膠體金檢測方法。
[0019] 酶聯免疫吸附實驗(ELISA)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標 記的抗原抗體反應在固相表面進行的技術。該技術可用于檢測大分子抗原和特異性抗體 等，具有快速、靈敏、簡便、載體易于標準化等優點。ELISA檢測試劑盒根據檢測目的和操作 步驟可分為間接法、雙抗夾心法、競爭法、雙位點一步法、捕獲法測IgM抗體、應用親和素和 生物素的ELISA JLISA檢測試劑盒中生色底物可選擇辣根過氧化物酶(HRP)或者堿性磷酸 酶(AP)。
[0020] 常用的免疫膠體金檢測技術：（1)免疫膠體金光鏡染色法細胞懸液涂片或外周血 切片，可用膠體金標記的抗體進行染色，也可在膠體金標記的基礎上，以銀顯影液增強標 記，使被還原的銀原子沉積于已標記的金顆粒表面，可明顯增強膠體金標記的敏感性。（2) 免疫膠體金電鏡染色法可用膠體金標記的抗體或抗抗體與負染病毒樣本或外周血超薄切 片結合，然后進行負染。可用于病毒形態的觀察和病毒檢測。（3)斑點免疫金滲濾法應用微 孔濾膜作載體，先將抗原或抗體點于膜上，封閉后加待檢樣本，洗滌后用膠體金標記的抗體 檢測相應的抗原或抗體。（4)膠體金免疫層析法將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜 上，膠體金標記試劑(抗體或單克隆抗體)吸附在結合墊上，當待檢樣本加到試紙條一端的 樣本墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解結合墊上的膠體金標記試劑后相互反應，當移動 至固定的抗原或抗體的區域時，待檢物與金標試劑的結合物又與之發生特異性結合而被截 留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結果。該法現已發展成為診斷試紙條，使用十 分方便。
[0021 ] 進一步，所述檢測LRRC26蛋白的ELISA法為使用ELISA檢測試劑盒。所述試劑盒中 的抗體可采用市售的LRRC26單克隆抗體。進一步，所述的試劑盒包括:包被LRRC26單克隆抗 體的固相載體，酶標二抗，酶的底物，蛋白標準品，陰性對照品，稀釋液，洗滌液，酶反應終止 液等。
[0022]進一步，所述檢測LRRC26蛋白的膠體金法為使用檢測試劑盒，所述的抗體可采用 市售的LRRC26單克隆抗體。進一步，所述的膠體金檢測試劑盒采用膠體金免疫層析技術或 膠體金滲濾法。進一步，所述的膠體金檢測試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測區（T)噴點有抗 LRRC26單克隆抗體、質控區(C)噴點有免疫球蛋白IgG。
[0023] 本發明的目的在于提供一種檢測口腔癌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述 試劑盒檢測基因 LRRC26,采用特異的上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQ ID N0.1， 下游引物序列為SEQ ID NO.2。