用于鑒定嚙書虱的引物對LcF2和LcR3的靈敏性檢測結果。
[0059] 圖12為用于鑒定暗褐書虱的引物對bruFl和bruR2的靈敏性檢測結果。
[0060] 圖13為用于鑒定虛偽書虱的引物對mendFl和mendR2的靈敏性檢測結果。
[0061] 圖14為用于鑒定皮氏書虱的引物對pearFl和pearR2的靈敏性檢測結果。
[0062] 圖15為用于鑒定三色書虱的引物對triFl和triR2的靈敏性檢測結果。
[0063] 圖16為用于鑒定紅書虱的引物對rufaFl和rufaRl的靈敏性檢測結果。
【具體實施方式】
[0064] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0065] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0066] 以下實施例進一步說明本
【發明內容】
，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方 法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，
[0067] 均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重 復實驗，結果取平均值。
[0068] 嗜蟲書風[Liposcelis entomophila (Enderlein)](樣本1 :米集自中國廣西黃梁 夢的嗜蟲書虱；樣本2 :采集自捷克中波西米亞的嗜蟲書虱；樣本3 :采集自美國堪薩斯的 嗜蟲書風）、嗜卷書風（L. bostrychophila Badonnel)(樣本4:采集自中國重慶的嗜卷書 虱；樣本5 :采集自捷克中波西米亞的嗜卷書虱；樣本6 :采集自美國堪薩斯的嗜卷書虱）、 無色書風[L. decolor (Pearman)](樣本7 :采集自中國重慶的無色書風；樣本8 :采集自捷 克中波西米亞的無色書虱；樣本9 :采集自美國堪薩斯的無色書虱）、小眼書虱（L. paeta Pearman)(樣本10 :采集自中國浙江的小眼書風；樣本11 :采集自捷克中波西米亞的小眼 書風；樣本12 :采集自美國堪薩斯的小眼書風）、嚙書風[L. corrodens(Heymons)](樣本 13 :采集自捷克中波西米亞的嚙書虱；樣本14 :采集自美國堪薩斯的嚙書虱；樣本15 :采集 自葡萄牙的嚙書風）、暗褐書風（L. brunnea Motschulsky)(樣本16 :采集自捷克中波西米 亞的暗褐書風；樣本17 :采集自美國堪薩斯的暗褐書風）、虛偽書風（L.mendax Pearman) (樣本18 :采集自中國江蘇鹽城的虛偽書風）、皮氏書風（L. pearmani Lienhard)(樣本19 : 采集自美國堪薩斯的皮氏書風）、三色書風（L. tricolor Badonnel)(樣本20 :采集自中國 山東菏澤的三色書風）、紅書風（L. rufa Broadhead)(樣本21 :采集自美國堪薩斯的紅書 虱）；
[0069] 以上嗜蟲書虱、嗜卷書虱、無色書虱、小眼書虱、嚙書虱、暗褐書虱、虛偽書虱在文 獻"趙朔，李志紅，秦萌.書虱及其分子生物學研究進展.植物保護，2009, 35 (6) : 17-21. " 中公開過，公眾可從中國農業大學獲得。
[0070] 以上三色書虱在文獻"董鵬，王進軍.三色書虱體內共生微生物Wolbachia的wsp 基因的分子檢測.動物學研究，2004, 25(5) :456-459. "中公開過，公眾可從中國農業大學 獲得。
[0071] 以上紅書虱和皮氏書虱在文獻"李法圣.中國嚙目志.北京：科學出版 社，2002:91-94. "中公開過，公眾可從中國農業大學獲得。
[0072] 實施例1、特異引物對的設計
[0073] 本發明在獲取十種種常見儲糧書虱線粒體C0I基因 DNA條形碼區段的基礎上，經 過序列的多重比對分析，針對八種常見倉儲書虱設計特異引物對，如表1所示。
[0074] 表1世界常見8種倉儲書虱特異引物一覽表
[0075]
[0076]
[0077] 實施例2、引物的特異性檢測
[0078] 一、entoF3和entoR2的特異性檢測
[0079](一）采用CTAB法分別提取樣本1-樣本21的倉儲書虱的單頭（或多頭）的基因 組 DNA。
[0080] (二）以步驟（一）得到的各個基因組DNA為模板，以entoF3和entoR2為引物進 行PCR擴增，得到各PCR擴增產物，同時以ddH 20代替模板作為陰性對照。
[0081] PCR擴增體系（總體積為25μ L) :2XTaq PCR MasterMix(購自生工生物工程（上 海）股份有限公司）12. 5 μ L，ddH20 9. 5 μ L，濃度為100-300ng/ μ L的模板1 μ L，濃度為 10 μ Μ的引物各1 μ L。
[0082] PCR 擴增程序：94°C 預變性 3min ;94°C 變性 30sec，50°C 退火 30sec，72°C 延伸 30sec，30 個循環；72°C延伸 5min。
[0083] (三）將各PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1所示。
[0084] 圖1中，M :DNA相對分子量標準（D2000) ;1至21依次為樣本1至樣本21的PCR 擴增產物，22為陰性對照。
[0085] 圖1表明，采集自不同地理種群的嗜蟲書虱（樣本1至樣本3)均顯示一條369bp 大小的特異條帶，而其他樣本均不顯示任何條帶。
[0086] 二、decF2和decR4的特異性檢測
[0087] 實驗過程如步驟一，僅將引物替換為decF2和decR4,結果如圖2所示。
[0088] 圖2中的各泳道的樣本與圖1中的一致。
[0089] 圖2表明，采集自不同地理種群的無色書虱（樣本7至樣本9)均顯示一條300bp 大小的特異條帶，而其他樣本均不顯示任何條帶。
[0090] 三、LcF2和LcR3的特異性檢測
[0091] 實驗過程如步驟一，僅將引物替換為LcF2和LcR3,結果如圖3所示。
[0092] 圖3中的各泳道的樣本與圖1中的一致。
[0093] 圖3表明，米集自不同地理種群的嚙書風（樣本13至樣本15)均顯不一條200bp 大小的特異條帶，而其他樣本均不顯示任何條帶。
[0094] 四、bruFl和bruR2的特異性檢測
[0095] 實驗過程如步驟一，僅將引物替換為bruFl和bruR2,結果如圖4所示。
[0096] 圖4中的各泳道的樣本與圖1中的一致。
[0097] 圖4表明，米集自不同地理種群的暗褐書風（樣本16至樣本17)均顯不一條450bp 大小的特異條帶，而其他樣本均不顯示任何條帶。
[0098] 五、mendFl和mendR2的特異性檢測
[0099] 實驗過程如步驟一，僅將引物替換為mendFl和mendR2,結果如圖5所示。
[0100] 圖5中的各泳道的樣本與圖1中的一致。
[0101] 圖5表明，虛偽書風（樣本18)顯示一條506bp大小的特異條帶，而其他樣本均不 顯示任何條帶。
[0102] 六、pearFl和pearR2的特異性檢測
[0103] 實驗過程如步驟一，僅將引物替換為pearFl和pearR2,結果如圖6所示。
[0104] 圖6中的各泳道的樣本與圖1中的一致。
[0105] 圖6表明，皮氏書風（樣本19)顯示一條293bp大小的特異條帶，而其他樣本均不 顯示任何條帶。
[0106] 七、triFl和triR2的特異性檢測
[0107] 實驗過程如步驟一，僅將引物替換為triFl和triR2,結果如圖7所示。
[0108] 圖7中的各泳道的樣本與圖1中的一致。
[0109] 圖7表明，三色書虱（樣本20)均顯示一條257bp大小的特異條帶，而其他樣本均 不顯示任何條帶。
[0110] 八、rufaFl和rufaRl的特異性檢測
[0111] 實驗過程如步驟一，僅將引物替換為rufaFl和rufaRl,結果如圖8所示。
[0112] 圖8中的各泳道的樣本與圖1中的一致。
[0113] 圖8表明，紅書風（樣本21)顯示一條335bp大小的特異條帶，而其他樣本均不顯 示任何條帶。
[0114] 以上結果表明，八種書虱的不同特異引物對（嗜蟲書虱_entoF3和entoR2,無色書 虱-decF2和decR4,嚙書虱-LcF2和LcR3,暗褐書虱-bruFl和bruR2,虛偽書虱-mendFl和 mendR2,皮氏書風-pearFl 和 pearR2,三色書風-triFl 和 triR2,紅書風-rufaFl 和 rufaRl) 分別能從對應的書虱中擴增出特定長度片段的PCR產物，而對其他種無目的條帶，結果明 確，易于分辨。
[0115] 實施例3、引物的靈敏性檢測
[0116] 一、entoF3和entoR2的靈敏性檢測
[0117] (一）采用CTAB法提取樣本2的基因組DNA，并將其稀釋為0.01ng/yL，0· lng/ μ L，lng/ μ L，5ng/ μ L，10ng/ μ L，25ng/ μ L，50ng/ μ L，75ng/ μ L 和 100ng/ μ L 的濃度。
[0118] (二）以步驟（一）得到的各個稀釋度的基因組DNA為模板，以entoF3和entoR2 為引物進行PCR擴增，得到各PCR擴增產物，同時以ddH20代替模板作為陰性對照。
[0119] PCR擴增體系如實施例2。
[0120] PCR擴增程序如實施例2。
[0121] (三）將各PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖9所示。
[0122] 圖9中，M:DNA相對分子量標準（D2000) ;1至9依次為以0.01ng/yL，(X Ing/yL， lng/ μ L，5ng/ μ L，10ng/ μ L，25ng/ μ L，50ng/ μ L，75ng/ μ L 和 100ng/ μ L 9 種不同濃